circRNA与mRNA互作

韩国科学技术院Yoon Ki Kim研究团队揭示了circRNA可通过与mRNA的3′ UTR相互作用，将其携带的外显子连接复合体（EJC）定位在mRNA的3′ UTR附近，从而靶向调控无义介导的mRNA降解(NMD)机制。人工设计的circRNA，可靶向下调mRNA水平，为circRNA在基因沉默和疾病治疗中的潜在应用开辟了广阔前景。^[11]
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肿瘤疫苗类型包括肽/蛋白、树突状细胞(DC)和核酸(包括DNA和RNA疫苗)。其中RNA疫苗可在细胞质内快速表达抗原，从而导致强大的免疫激活，还可避免基因组整合和T细胞耐受性相关风险。加之circRNA的独特优势，可成为极具前景的肿瘤疫苗载体。

斯坦福大学的张元豪和Wender研究团队利用circRNA编码卵清蛋白 (OVA)^[27]，多伦多大学李博文团队利用circRNA编码IL-12^[28]、福建医科大学孟超肝胆医院刘小龙/赵必星团队利用circRNA编码新抗原PTPN2多肽片段^[29]，结果发现这些circRNA肿瘤疫苗均可在模型体内诱导强烈的抗肿瘤免疫反应，且能强效、安全、稳定抑制肿瘤生长，甚至清除肿瘤，效果显著优于线性mRNA，且无明显副作用。

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中山大学附属第一医院张弩团队联合吉赛生物团队开发表达lncRNA编码肽肿瘤抗原的疫苗circH19-vac，可触发针对胶质母细胞瘤的强效细胞毒性T细胞反应并抑制肿瘤生长。^[30]

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circRNA还有望成为优越的肿瘤抗原载体，开发有效的DC疫苗。吉林大学张海红团队开发编码肿瘤抗原FAPα和survivin的circRNA DC疫苗，可显著抑制肿瘤生长，与吉西他滨药物进行联合治疗，显著延长了胰腺癌小鼠的存活率。^[31]

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图4 circRNA疫苗激活免疫反应。^[32]

CAR-T疗法

检索式：(circRNA[Title/Abstract]) OR circular RNA[Title/Abstract]

01 环状RNA翻译的分子机制

标题：Molecular mechanisms of circular RNA translation

杂志：Exp Mol Med

影响因子：12.8

通讯作者：Yoon Ki Kim（韩国科学技术院）

DOI: 10.1038/s12276-024-01220-3

环状RNA (circRNAs)是共价封闭的单链RNA，没有典型真核细胞mRNA中的5’帽结构和3′ poly(a)尾。环状RNA主要通过细胞核内的反向剪接过程产生。circRNA长期以来被认为是非编码RNA，似乎没有蛋白质编码潜力。然而，最近的许多研究反驳了这一观点，并提供了大量证据表明，circRNA的一个子集与多聚体相关，且确实可以进行翻译。因此，在这篇综述主要强调了发生在环状RNA上不依赖于5’帽的内部翻译起始。环状RNA的一些对其高效的内部翻译起着关键作用的分子特征，包括内部核糖体进入位点、N6 -甲基腺苷修饰以及在反剪接事件后在反剪接连接处周围形成的外显子连接复合体。该文章还提出了circRNA的可翻译性与其稳定性之间的可能关系，重点关注无义介导的mRNA衰变和nonstop衰变，这两种机制都是有效的mRNA监控机制。对circRNA翻译的深入理解将重塑和扩展我们目前对蛋白质组学的认识。

02 环状RNA合成的优化设计

标题：Optimal design of synthetic circular RNAs

杂志：Exp Mol Med

影响因子：12.8

通讯作者：Jin-Wu Nam（韩国汉阳大学）

DOI: 10.1038/s12276-024-01251-w

环状RNA是一类不寻常的单链RNA，其末端通过反剪接共价连接。由于它们的多功能性，在体内和体外表达环状RNA的需求不断增加。人们一直在努力高效、精确地合成环状RNA。然而，对环状RNA设计、合成和传递过程的优化研究尚缺乏综述。该综述强调了在产生最佳环状RNA时所考虑的多方面，并总结了外源性环状RNA设计和合成的每个步骤的不同方案，包括环状化策略。此外，该文还介绍了环状RNA的几种潜在应用。

03 自噬相关的CircDHX8促进ATG2B与RNF5结合，提高ATG2B的稳定和人胃癌的进展

标题：Human gastric cancer progression and stabilization of ATG2B through RNF5 binding facilitated by autophagy-associated CircDHX8

杂志：Cell Death Dis

影响因子：9.0

通讯作者：吴川清副教授（华中科技大学同济医学院附属协和医院）

DOI: 10.1038/s41419-024-06782-8

circDHX8在自噬和胃癌(GC)进展之间的相互作用中的作用尚不清楚。该研究阐述了hsa_circ_003899 (circDHX8)在GC恶性肿瘤中的作用机制。使用circle-seq和微阵列数据集(GSE83521)测定GC和正常组织中circRNAs的差异表达。使用qPCR和Sanger测序对这些环状RNA进行验证。通过干扰circDHX8在体外和体内的表达实验研究circDHX8的功能。Western blotting、免疫荧光和透射电镜检测circDHX8是否促进GC细胞自噬。为了阐明circdhx8介导的自噬调节机制，该研究进行了生物信息学分析、RNA pull-down、质谱(MS)、RNA免疫沉淀(RIP)和其他western Blot相关实验。Hsa_circ_0003899 (circDHX8)被鉴定为上调，并显示通过促进细胞自噬从而促进GC细胞的恶性进展。从机制上讲，circDHX8通过阻止泛素介导的降解，提高ATG2B蛋白水平，从而促进GC细胞的增殖和侵袭。此外，circDHX8直接与E3泛素蛋白连接酶RNF5相互作用，抑制RNF5介导的ATG2B降解。同时，乙酰化蛋白ATG2B经过SIRT1介导的去乙酰化，增强其与RNF5的结合。该研究建立了circDHX8在GC恶性进展中作用的新机制。

04 CircR-loop:一种新的RNA:DNA相互作用对基因组不稳定性的影响

标题：CircR-loop: a novel RNA:DNA interaction on genome instability

杂志：Cell Mol Biol Lett

影响因子：8.3

通讯作者：段世伟教授（浙大城市学院）

DOI: 10.1186/s11658-024-00606-5

CircR-loop是最近在环状RNA和DNA相互作用的调控机制中发现，是R-loop的一个子集。在动物和植物系统中，CircR-loop在关键调控功能中发挥着至关重要的作用。该研究领域始于circR-loop在人类线粒体基因组中的发现，circR-loop是线粒体DNA复制的关键。在植物界，circR-loop调控可变剪接和着丝粒分配等过程，分别影响着花发育的复杂性和基因组的稳定性。它们在动物领域也同样重要，circR-loop在癌症中与转录控制、染色质结构和对DNA损伤的协调反应有关，因此备受关注。此外，它们参与核输出异常进一步强调了其在细胞调节中的突出作用。该文综述了circR-loop在植物和动物中的重要调控机制和生理作用，并对circR-loop的鉴定、表征和功能分析方法进行了全面的探讨，强调了迫切需要创新的方法将其与线性RNA对应物有效地区分开，同时阐明其准确的功能。最后，文章阐明了circR-loop研究领域面临的挑战和机遇，强调了继续研究以揭示其在生物学领域的调节作用和潜在应用的重要性。综上所述，circR-loop代表了一种有趣的新型调控机制，在遗传学、表观遗传学和疾病生物学领域具有广泛的意义。对circR-loop的研究为理解基因调控开辟了新的途径，并为未来的治疗干预提供了重要的希望。

研究汇总列表

2024年3月9日，南方医科大学南方医院泌尿外科谭万龙教授团队研究发现在Molecular Cancer（IF=37.3）发表文章：Bladder-cancer-derived exosomal circRNA_0013936 promotes suppressive immunity by up-regulating fatty acid transporter protein 2 and down-regulating receptor-interacting protein kinase 3 in PMNMDSCs。本研究表明在PMN-MDSCs中，BCa来源的外泌体circRNA_0013936通过
circRNA_0013936/miR-320a/JAK2通路上调FATP2，通过circRNA_0013936/ miR-301b-3p/CREB1通路下调RIPK3，从而促进抑制性免疫。这些发现有助于为人类膀胱癌的临床治疗找到新的靶点。

PMN-MDSCs浸润性膀胱肿瘤组织中FATP2和RIPK3的表达

作者采用免疫荧光法检测肿瘤组织中PMN-MDSCs的浸润情况。双阳性细胞（CD11b+/LOX-1+）被标记为PMN-MDSCs。免疫组化显示FATP2和RIPK3的表达。图1A显示肿瘤组织中存在大量的PMN-MDSCs。肿瘤组织中FATP2的表达显著上调，而RIPK3的表达显著下调（图1B-C）。统计分析结果显示，膀胱肿瘤组织中PMN-MDSCs的浸润与FATP2的表达呈正相关，与RIPK3的表达呈负相关（图1D-E）。免疫组化结果显示，LOX-1和FATP2在人膀胱肿瘤组织中的表达高于癌旁组织，而RIPK3的表达低于癌旁组织（图1F）。此外，与I/II期患者相比，III/IV期患者在肿瘤组织中FATP2高表达，RIPK3低表达（图1G）。

图1 PMN-MDSCs浸润肿瘤微环境，过表达FATP2，低表达RIPK3

BCa衍生的外泌体上调PMN-MDSCs中的FATP2，下调RIPK3

透射电镜显示，BCa衍生的外泌体具有完整的、连续的双层膜，这是外泌体的典型形态学特征（图2A）。与PMN-MDSCs共培养后，用荧光PKH67标记的BCa衍生的外泌体被PMN-MDSCs内化（图2B）。当PMN-MDSCs与BCa来源的外泌体共培养时，PMN-MDSCs中FATP2的表达显著上调，而RIPK3的表达显著下调（图2C-D）。LC-MS分析显示，BCa衍生的外泌体促进了PMN-MDSCs中脂质代谢分子（PGE2、TG、AA）的合成（图2E）。此外，ELISA分析显示，BCa衍生的外泌体促进了PMN-MDSCs中免疫抑制分子（IL-10、iNOS、Arg-1）的合成（图2F）。

图2 BCa衍生的外泌体上调PMN-MDSCs中的FATP2，下调RIPK3

circRNA_0013936在BCa衍生的外泌体中的鉴定和表征

作者采用高通量测序来鉴定BCa衍生的外泌体中差异表达的环状RNA。其中，环状RNA表达上调比下调的环状RNA更普遍（图3A）。作者选择了10个上调最多的环状RNA。根据RNA测序和qRT-PCR结果，hsa_circ_0013936是表达差异最大的上调的circRNA（补充图2C）。图3B显示了circRNA_0013936的形成。qRT-PCR显示，与正常尿路上皮细胞来源的外泌体相比，三种BCa细胞来源的外泌体中circRNA_0013936的表达显著上调（图3C）。此外，作者还设计了聚合引物和发散引物来扩增circRNA_0013936。以UMUC3和T24细胞系的cDNA和gDNA（基因组DNA）为模板，仅在cDNA中使用发散引物扩增到circRNA_0013936，gDNA中未见扩增产物（图3D）。通过qRT-PCR，作者进一步证实了circRNA_0013936对RNase R具有耐受性（图3E）。FISH分析显示，circRNA_ 0013936主要位于膀胱肿瘤细胞的细胞质中（图3F）。

图3 circRNA_0013936的鉴定和表征

CircRNA_ 0013936在PMN-MDSCs中上调FATP2，下调RIPK3

为了证实circRNA_0013936可以在PMN-MDSCs中上调FATP2的表达，下调RIPK3的表达，作者用circRNA_0013936模拟物转染了PMN-MDSCs。Western blot结果显示，circRNA_0013936模拟物显著上调了PMNMDSCs中FATP2的表达，下调了RIPK3的表达（图4A-B）。ELISA分析显示，circRNA_0013936模拟物促进了PMN-MDSCs中免疫抑制细胞因子（Arg-1、IL-10、iNOS）的合成（图4C）。LC-MS分析显示，circRNA_0013936模拟物增加了PMN-MDSCs中脂质代谢分子（AA、TG、PGE2）的水平（图4D）。

图4 CircRNA_ 0013936在PMN-MDSCs中上调FATP2，下调RIPK3

CircRNA_ 0013936可以作为miR-320a和miR-301b-3p的海绵

为了研究circRNA_0013936是否可以在PMN-MDSCs中海绵化miRNA，作者通过CircInteractome数据库以及荧光素酶报告基因分析实验，发现了3个候选miRNA（图5A）。然后使用生物素化circRNA探针下拉PMN-MDSCs中的circRNA_0013936（图5B）。RIP实验发现circRNA_0013936、miR-320a和miR- 301b-3p特异性富集，表明miR-320a和miR- 301b-3p是PMN-MDSCs中与circRNA_0013936相关的miRNA（图5C）。图5D显示了miR-320a和miR-301b-3p在PMN-MDSCs中的基本表达情况。为了进一步证实miR-320a和miR-301b-3p是否能与circRNA_0013936结合，作者在293T细胞中进行了双荧光素酶报告实验。结果显示，miR-320a和miR-301b-3p mimic均显著降低了WT-circRNA_0013936的荧光素酶活性（图5E-G）。这些结果表明，circRNA_0013936可作为miR- 320a和miR-301b-3p的海绵发挥作用。

图5 CircRNA_ 0013936可作为miR-320a和miR-301b-3p的海绵

JAK2是miR-320a的直接靶基因，而CREB1是miR-301b-3p的直接靶基因

为了进一步探索其潜在机制，作者利用Targetscan、miRDB、DIANA-microT和Starbase预测miR-320a和miR-301b-3p的靶基因。此外，作者通过RNA测序分析了PMN-MDSCs（circ_0013936-sh vs. circ_0013936-nc）中的差异基因表达。根据RNA测序结果和对靶基因的预测，作者发现miR-320a和miR-301b-3p的下游靶基因分别有9个基因和7个基因（图6A和G）。然后，通过qRT-PCR来验证候选基因。在含有miR-320a保守结合位点的基因中，JAK2在PMN-MDSC-lv-circ_0013936中上调，在PMN-MDSC-sh-circ_0013936中下调（图6B）。在含有miR-301b-3p保守结合位点的基因中，CREB1在PMN-MDSC-lv-circ_0013936中上调，在PMN-MDSC-sh-circ_0013936中下调（图6H）。

此外，双荧光素酶报告基因检测显示，miR-320a模拟物显著降低了JAK2野生型的活性，但没有降低JAK2突变体的活性（图6C-D），miR-301b-3p模拟物显著降低了CREB1野生型的活性，但没有降低CREB1突变体的活性（图6J-K）。此外，如图6J-K和L-M所示，在转染miR-320a/miR-301b-3p模拟物或miR-320a/miR-301b-3p抑制剂的PMN-MDSCs中，JAK2和CREB1的表达在mRNA和蛋白水平上均显著上调或下调。

图6 JAK2是miR-320a的直接靶基因，而CREB1是miR-301b-3p的直接靶基因

CircRNA_0013936通过
circ_0013936/miR-320a/JAK2通路上调FATP2，通过circ_0013936/ miR-301b-3p/ CREB1通路下调RIPK3

CircRNA_0013936通过促进PMN-MDSCs中JAK2的表达来增加FATP2的表达，这一作用可被miR-320a模拟物逆转。circRNA_0013936的敲低通过降低JAK2的表达来抑制FATP2的表达，而miR-320a抑制剂可以逆转此现象（图7A-C）。CircRNA_0013936通过增加CREB1的表达来抑制PMN-MDSCs中RIPK3的表达，这一作用可被miR-301b-3p模拟物逆转。相反，敲低CircRNA_0013936会通过降低CREB1的表达促进RIPK3的表达，而miR-301b-3p抑制剂可逆转这一现象（图7H-J）。qRT-PCR和Western blot分析结果显示，敲低JAK2或CREB1可显著下调FATP2的表达或上调RIPK3的表达，并这一现象可通过过表达JAK2或CREB1来逆转（图7D-F和K-M）。CircRNA_0013936促进了PMN-MDSCs衍生的细胞因子（Arg-1、IL-10、iNOS、AA、TG、PGE2）的产生，这一作用可被miR-320a或miR-301b-3p模拟物逆转。而敲低circRNA_0013936则抑制了PMN-MDSCs衍生的细胞因子的产生，这可被miR-320a或miR-301b-3p抑制剂所逆转（图7G和N）。综上所述，circRNA_0013936通过海绵化miR-320a和miR-301b-3p来调控FATP2和RIPK3的表达。

图7 CircRNA_0013936通过miR-320a/JAK2和miR-301b-3p/CREB1通路上调FATP2和下调RIPK3

在PMN-MDSCs中，外泌体circRNA_0013936通过
circ_0013936/miR-320a/JAK2通路上调FATP2，通过circ_0013936/ miR-301b-3p/ CREB1通路下调RIPK3，从而促进抑制性免疫

为了研究BCa衍生的外泌体circRNA_0013936是否通过miR-320a/JAK2和miR- 301b-3p/CREB1通路调控PMN-MDSCs中FATP2和RIPK3的表达，作者使用CRISPR-Cas9基因组编辑系统生成了circRNA_0013936敲除膀胱癌细胞。然后，作者检测了与BCa-外泌体或circRNA_0013936-KO-Bca-外泌体共培养的PMN-MDSCs中FATP2和RIPK3的表达。图8A-B，BCa衍生的外泌体circRNA_0013936海绵化miR-320a，通过激活JAK2/pSTAT5通路促进FATP2的表达，而circRNA_0013936-KO-外泌体则表现出相反的作用。同时，BCa衍生的外泌体circRNA_0013936海绵化miR-301b-3p，然后通过激活CREB1通路抑制RIPK3的表达，而circRNA_0013936-KO-外泌体则表现出相反的作用（图8D-E）。最终，BCa衍生的外泌体circRNA_0013936促进了PMN-MDSCs的免疫抑制细胞因子的产生（图8C，F）。

为了研究BCa来源的外泌体circRNA_0013936是否通过调节PMN-MDSCs中的FATP2和RIPK3来影响CD8+ T细胞的功能，作者将CD8+ T细胞与BCa来源的外泌体或circRNA_0013936-KO-BCa-外泌体诱导的PMN-MDSCs共培养。流式细胞术和CFSE分析结果显示，BCa来源的外泌体通过调节FATP2和RIPK3的表达，显著抑制了IFN-γ的产生和CD8+ T细胞的增殖功能，而circRNA_0013936-KO-BCa-外泌体则表现出相反的作用（图8G-H）

图8 在PMN-MDSCs中，外泌体circRNA_0013936通过miR-320a/JAK2通路上调FATP2，通过miR-301b-3p/CREB1通路下调RIPK3，从而促进抑制性免疫

小结

在BCa衍生的外泌体中富集的CircRNA_0013936可以促进FATP2的表达，并抑制PMN-MDSCs中RIPK3的表达。在机制上，circRNA_0013936通过海绵化miR-320a和miR-301b促进RIPK2的表达，而miR-301b分别直接靶向JAK2和CREB1，抑制RIPK3的表达。最终，circRNA_0013936在PMN-MDSCs中，通过
circRNA_0013936/miR-320a/JAK2通路上调FATP2，通过circRNA_0013936/miR-301b/CREB1通路下调RIPK3，显著抑制CD8+ T细胞的功能。结果表明，circRNA_0013936有望成为BCa的有效治疗靶点。这些发现为膀胱癌的临床治疗提供了理论基础和新的思路。

2024年2月21日，汕头大学医学院附属肿瘤医院陈创珍团队在JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH（IF=11.3）发表文章A tumor suppressor protein encoded by circKEAP1 inhibits osteosarcoma cell stemness and metastasis by promoting vimentin proteasome degradation and activating anti-tumor immunity。结果显示，作者通过微阵列分析技术鉴定OS与正常组织之间差异表达的circKEAP1（hsa_circ_0049271），在OS肿瘤中的表达下调，并与癌症患者更好的生存率相关。进一步分析发现circKEAP1含有777 nt长的ORF，并编码的新蛋白KEAP1-259aa。从机制上讲，KEAP1-259aa可通过与E3连接酶ARIH1相互作用促进波形蛋白酶体降解以此抑制OS细胞的增殖、侵袭。此外，circKEAP1与RIG-I相互作用，通过IFN-γ途径激活抗肿瘤免疫，为OS治疗提供了新的潜在靶点。

一、circKEAP1在OS组织中特异低调

作者通过3对OS及正常组织进行微阵列分析，并鉴定了一系列的差异表达的circRNA，通过GO富集分析，选择前5个差异表达的circRNA，并通过qPCR/divergent primer sanger测序/R酶消化富集实验及GEO数据库中发现circKEAP1(hsa_circ_0049271)是OS中明显低调及确定是反向剪切形成稳定的circRNA结构。其次作者通过核质分离及FISH实验检测到circKEAP1主要定位在细胞质中，同时卡普兰-迈尔生存分析（Kaplan-Meier survival analysis）/ROC曲线分析发现circKEAP1表达水平较高的OS患者的总体生存时间更长，circKEAP1可作为诊断OS的候选标志物。

图1. 微阵列分析鉴定OS相关的circRNA

二、circKEAP1抑制OS细胞的增殖、迁移和干性

作者通过CCK8/克隆形成/流式检测/细胞划痕/Transwell侵袭发现circKEAP1抑制OS细胞的增殖并增加了OS细胞的凋亡，进一步证实了对OS细胞迁移的抑制。同时使用异种移植模型/IHC说明了circKEAP1降低了OS细胞肺转移的感染能力并减弱肿瘤的生长。

图2. circKEAP1的表征及其在OS中的功能

三、circKEAP1可编码蛋白 KEAP1-259aa

作者进一步通过circRNADb数据库预测circKEAP1有一个777长度的ORF，可编码一个259aa的蛋白，并通过构建双荧光素酶/过表达FLAG标签载体/敲低载体/液相色谱-质谱/免疫荧光验证了circKEAP1的IRES活性和蛋白表达。同时使用KEAP1商业化抗体检测了8对OS组织发现与正常组织相比，OS组织中的KEAP1-259aa的表达水平较低。 

图3. circKEAP1编码一种新型蛋白质推测起在OS中发挥的机制

四、新蛋白KEAP1-259aa发挥肿瘤抑制作用

作者进一步分析KEAP1-259aa的生物学功能，通过过表达circKEAP及IRES、ATG突变载体/CCK8/流式检测/细胞划痕/Transwell侵袭，发现KEAP1-259aa抑制OS细胞的增殖和克隆形成及调节细胞迁移能力，并通过流式/WB检测相关干细胞标志物的下调及肿瘤球形成试验/裸鼠皮下注射实验发现该蛋白可抑制肿瘤的形成。

图4. KEAP1-259aa可抑制OS细胞的增殖、侵袭和干性

五、KEAP1-259aa通过与E3连接酶ARIH1结合促进波形蛋白酶体降解

作者为了进一步探究KEAP1-259aa抑制OS恶性肿瘤的分子机制，开展了基于质谱的甲醛交联实验，通过GO富集分析表明KEAP1-259aa结合蛋白与翻译后修饰有关，其中最显著的是vimentin波形蛋白和泛素转移E3连接酶ARIH1，并通过CO-IP/免疫荧光染色实验进一步验证它们之间的互作。作者也发现了过表达KEAP1-259aa降低了波形蛋白的表达水平，与对照相比，波形蛋白的降解速度更快，但是用CHX处理（蛋白质合成抑制剂），敲低ARIH1恢复了波形蛋白的表达。此外，KEAP1-259aa介导的波形蛋白稳定性下降被蛋白酶体抑制剂MG132逆转。同时用HA抗体检测GFP ip下的蛋白发现，KEAP1-259aa诱导了波形蛋白的泛素化水平修饰。为了进一步测试KEAP1-259aa介导的波形蛋白的泛素降解是否与其磷酸化水平有关，构建了波形蛋白的野生型及丝氨酸突变型载体，IP实验结果显示KEAP1-259aa对39aa突变位点的波形蛋白的泛素化调节水平降低。

图5. KEAP1-259aa与ARIH1相互作用促进波形蛋白降解

六、circKEAP1通过vimentin发挥抑瘤作用

作者用WFA处理OS细胞后，circKEAP1敲低明显抑制细胞的增殖、集落形成、迁移和干性均降低，细胞凋亡增强。此外，在体内和体外用vimentin转染细胞时，circKEAP1没有发挥抑瘤作用。综上所述，这些发现表明circKEAP1编码的KEAP1-259aa通过抑制vimentin发挥肿瘤抑制作用。

图6. circKEAP1通过降低波形蛋白水平抑制OS恶性肿瘤

七、circKEAP1的m6A甲基化修饰调控作用

作者为了探索控制OS中circKEAP1水平的详细机制，进一步用SRAMP预测了m6A位点（A565G），RNA pulldown和RIP实验表明，circKEAP1可以与m6A甲基化修饰因子：METTL3、FTO和YTHDF1/2相互作用，并在circKEAP1在A565上存在m6A修饰位点，并通过降低其甲基化时的稳定性来调节circKEAP1的表达。

图7. circKEAP1的表达受m6A甲基化调节

八、circKEAP1在OS细胞中通过RIG-I通路触发免疫防御反应

作者为了深入研究circKEAP1在OS中的下游调控机制，进行了RNA-seq，通过GO和KEGG/GSEA富集分析/qRT-PCR发现circKEAP1参与I型干扰素(IFN)和免疫信号传导。之前的研究发下RIG-1的缺失与癌症免疫逃逸有关，通过敲低RIG-1发现circKEAP1诱导的免疫通路相关基因表达水平下调；同时用WB/ELISA/人炎症因子抗体芯片发现circKEAP1可促进RIG-1、p-IRF3、CXCL10、CCL5等免疫调节因子的表达。进一步通过RIP/FISH实验，circKEAP1可通过自身的CARD结构域与RIG-1结合，并共定位在细胞质中，这些结果表明circKEAP1的过表达通过 RIG-1来调控OS中相关免疫基因的上调。

图8. CircKEAP1通过RIG-I激活细胞免疫应答

总结

作者通过一系列实验证明了circKEAP1可以抑制肿瘤的生长、侵袭和增殖，并通过编码一个新型蛋白KEAP1-259aa，其与波形蛋白结合并通过与ARIH1相互作用促进波形蛋白降解。更重要的是，circKEAP1通过RIG-I信号通路激活抗肿瘤免疫。这些结果表明circKEAP1是OS中的一个重要治疗靶点。

图9. circKEAP1可在OS细胞中的调控机制

原文链接

https://jeccr.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13046-024-02971-7

参考文献

[1] Soghli N, Qujeq D, Yousefi T, Soghli N. The regulatory functions of circular RNAs in osteosarcoma. Genomics. 2020;112(4):2845–56.

[2] Wu Y, Xie Z, Chen J, Chen J, Ni W, Ma Y, Huang K, Wang G, Wang J, Ma J, et al. Circular RNA circTADA2A promotes osteosarcoma progression and metastasis by sponging miR-203a-3p and regulating CREB3 expression. Mol Cancer. 2019;18(1):73.

2023年10月28日，北京市神经外科研究所、首都医科大学附属北京天坛医院江涛教授团队在国际生物信息学领域权威学术期刊Nucleic Acids Research(14.9)在线发表题为“circRNADisease v2.0: an updated resource for high-quality experimentally supported circRNA-disease associations”的数据库论文。博士后孙志延、研究生杨昌霖、助理研究员黄立杰博士和香港科技大学莫宗超博士为共同第一作者，北京市神经外科研究所、附属北京天坛医院江涛教授、赵征副研究员与北京博奥晶典生物技术有限公司孟凡琳高级工程师为共同通讯作者。

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近年来，科学家们发现了一种不同于传统线性RNA的新型RNA，即环状RNA（circRNA）。环状RNA通过基因组DNA的正常转录形成一个共价封闭的环结构。相比线性RNA，环状RNA在各种生物物种中表达丰富且相对稳定，包括病毒和哺乳动物。越来越多的研究表明，环状RNA与疾病表型之间存在密切关联。然而，对于888集团官网游戏 关系的系统收集研究相对不足。

为了填补这一研究空白，2018年4月江涛教授团队发布了circRNADisease v1.0数据库(https://www.nature.com/articles/s41419-018-0503-3)。经过系统核实800多篇已发表的文献，并收集整理了330种circRNA和48种疾病。现在，他们推出的circRNADisease v2.0数据库是对之前版本的全面升级。团队系统地回顾了超过12,000篇已发表的文献，并手动整理并收集了6,998个888集团官网游戏 的关系，其中涉及4,246个circRNAs、330种疾病以及12个物种（图1）。此外，为了系统探究遗传变异对circRNA功能的潜在影响，团队还在30种TCGA人类癌症中鉴定了7,417,841个基因突变与circRNAs的关系。

图1.circRNADisease v2.0的数据扩展和特性。(A)数据收集。(B)数据处理。(C)数据库开发。

与其他数据库相比，circRNADisease 2.0具有五个独特的特点：

（1）数据库收录的疾病谱相较上一版本有了极大的扩充，更新后的疾病种类远超上版本数倍；

（2）circRNA的功能更全面，特别是有关circRNA在疾病中的生物功能、circRNA参与疾病的分子机制等内容也在新版数据库得到体现；

（3）提供了基于circRNA表达的患者预后状态，使circRNA与临床疾病的关系更为紧密；

（4）此版本不仅收集了人类的circRNA-疾病关系，还包括其他物种，如小鼠、大鼠等；

（5）新开发的“Circ2Mut”模块，可用于探索30种人类癌症中circRNA位点上的突变。

为了满足circRNA研究的需要，circRNADisease v2.0数据库将持续收集888集团官网游戏 的关联关系，并定期进行数据库的更新。团队致力于引入额外的分析工具，以增强数据库的功能，并计划将大量的生物数据和基于网络的功能性工具整合到circRNADisease 2.0数据库中。这将为科学家探究circRNA在疾病中的作用提供重要的信息资源。

用户使用手册

在circRNADisease v2.0中，搜集的文献数据经过精心组织，使用MySQL 14.14进行管理，并采用关系模式进行存储。这种组织结构将在未来的更新中继续得到支持，以确保与之前版本保持一致。该网站的代码是使用Java Server Pages（JSP）编写的，并使用Eclipse软件开发的Java Servlet框架来构建的。该网站托管在Tomcat 6.0.44 Web服务器上，并在CentOS 6.5 Linux系统上运行。数据和结果可视化是通过jQuery和dataTable生成、渲染和处理的。在“浏览”模块中，使用了zTreeStyle生成树状结构。该网站在Google Chrome v115.0.5790.170和Safari v15.4浏览器中经过了全面的测试。

与以前的版本相比，此次更新收集了更多的888集团官网游戏 的关系(表1)，同时重新设计了用户友好的网络界面(图2)。具体更新的功能如下：

表1. circRNADisease v2.0与v1.0更新要点比较。

图2.circRNADisease v2.0更新后各功能模块界面。(A)“Search”模块的界面提供了四种搜索方式，分别按circRNA、疾病、宿主基因和microRNA。(B)“Browse”模块的界面。(C)“Browse或“Search模块的详细结果界面。(D) “Circ2Mut”模块的接口。(E)“Submit”模块的接口。(F)“Download”模块界面

基于circRNADisease v2.0，发现过去几年来，越来越多的研究探索了888集团官网游戏 之间的关系（图3A）。当前版本的circRNADisease v2.0记录了12个物种（包括人类、小鼠、猪、秀丽隐杆线虫、鸡、牛、山羊、猪、大鼠、绵羊、病毒、海参）中6998个经实验证实的888集团官网游戏 的关联（图3B）。此外，一些circRNA（如circ_HIPK3、circ_CDR1和circ_PVT1等）和DO疾病（如胃癌、肝细胞癌、结直肠癌等）在circRNA研究领域得到广泛研究（图3C、D）。这些关于circRNA的持续研究在揭示疾病机制和促进新的治疗策略的开发方面起着至关重要的作用。

图3.circRNA社区广泛研究的统计。(A)按年出版的科学文献的数量。(B)不同物种涉及的888集团官网游戏 的关系。(C) circRNA中十大前沿研究888集团官网游戏 关系的数量社区。(D) circRNA界前10大前沿研究疾病的circRNA-disease关系数。

Home：网站主页介绍了这个项目的动机、信息收集、数据库内容和统计信息。此外，网站还提供了一个方便的搜索工具，使用户能够快速搜索广泛研究的circRNAs、宿主基因、疾病和miRNAs。所有记录都显示在搜索结果页面上。

Search：circRNADisease v2.0作为一个综合性平台，提供了四种不同的搜索方式：circRNA、宿主基因、疾病和miRNAs。例如，在搜索界面中，用户可以检索circRNA和疾病之间的关联。此外，该界面便于根据检测方法和特定的组织、细胞系或PDX来进行筛选。在结果页面上，用户可以使用模糊搜索输入来进行过滤、排序和下载结果表格。

Browse：新版网站重新设计了浏览页面，以提供对不同分类中的circRNA-疾病关系的访问，例如物种、circRNA ID/名称/同义词、circRNA宿主基因以及基于疾病本体的统一疾病名称。为了进一步提高用户效率，网站支持模糊搜索工具。这些工具能够通过密切匹配和近似用户输入来迅速准确地检索结果，即使存在轻微的变化或拼写错误。这一实施显著提高了整体用户体验，提供了更灵活和宽容的搜索功能。类似地，在搜索结果页面上，用户可以浏览每个条目的更多详细信息。这个功能允许用户深入了解他们感兴趣的具体信息，增强了他们对浏览结果的理解和探索。

Circ2Mut：Circ2Mut是一个高级模块，用于检索circRNA位点内的突变。Circ2Mut专注于识别circRNA位点内的突变，帮助研究人员发现影响circRNA功能的遗传变异。它允许研究人员探索circRNA位点内的突变，最终促进对疾病背景下异常circRNA生物合成和表达的更深入理解。

Download：circRNADisease v2.0中收集的所有数据都可以免费访问。用户可以从专用的“下载”页面下载整个数据集，或选择感兴趣的特定部分。此外，用户可以通过“搜索”和“浏览”模块上的结果界面方便地访问结果数据，提供个性化查询并在搜索后下载结果表格。

Submit & Help ：circRNADisease v2.0 鼓励科研人员通过主页上的Submit 模块提交有关circRNA最新的研究成果（包括但不限于，circRNA的名称，学术成果的PubMed ID，涉及的疾病，具体的调控方式以及更多的细节描述）。同时也鼓励研究者通过Help界面获得网站使用的系统教程。

示例演示

circRNADisease v2.0数据库应用举例。在搜索模块的“Search by Disease”页面中，用户可以通过选择“human”物种，输入“brain glioma”作为疾病关键字，检索与人类胶质瘤相关的circRNAs研究。这项研究得出了人类大脑胶质瘤和circRNAs之间的186种记录关系。例如，circNEIL3已被鉴定为ADAR1表达的调节剂，通过充当miR-432-5p的海绵，导致胶质瘤相关癌基因1 (GLI1)的RNA编辑。这一过程最终影响细胞周期进程，促进胰腺导管腺癌(PDAC)细胞的上皮-间质转化(EMT)。Pan等人发现，在脑胶质瘤的情况下，通过circNEIL3稳定IGF2BP3，诱导EWSR1促进胶质瘤的进展，促进外泌体介导的巨噬细胞免疫抑制极化。因此，circRNADisease v2.0提供了circrna -疾病关系的基本总结信息，并促进了进一步的研究。

原文链接：

https://doi.org/10.1093/nar/gkad949

详情见：Nucleic Acids Res | 北京生科院赵方庆团队更新circAtlas 3.0 版本：环状RNA全面信息的综合数据库

很快，在2023年10月12日，Nucleic Acids Research（IF=14.9）再一次刊发了关于纳米孔全长环状RNA的文章“FL-circAS: an integrative resource and analysis for full-length sequences and alternative splicing of circular RNAs with nanopore sequencing”，该研究成果由台湾省中央研究院的庄树谆教授团队分享。

作者认为，短读长测序虽然已经鉴定到了数百万的BSJ（back-spliced junction），然而确定其确切的全长以及可变剪切异构体仍具有很大的挑战性。而纳米孔全长环状RNA测序策略为解决这些问题提供了重要的通道。因此，作者收集了20个细胞系或组织已发表的三代测序数据，从中识别到了人和小鼠大量BSJ以及环状RNA全长异构体（或称为亚型），构建了FL-circAS数据库。

图1. Graphical Abstract

除了提供环状RNA全长和亚型信息，FL-circAS还囊括了环状RNA的多种特征，包括：

环状RNA分子刻画

– 每个BSJ和亚型的表达水平

– 细胞或组织特异性

– 以及每个BSJ发生可变剪切的信息熵

环状RNA的生物学起源

– BSJ侧翼序列的反向互补序列

– BSJ侧翼序列RBP结合位点

环状RNA功能

– miRNA结合位点

– RBP结合位点

– m6A修饰

– 翻译元件与翻译潜能

该数据库可以通过以下网址访问：

https://cosbi.ee.ncku.edu.tw/FL-circAS/

以下为文章的部分结果：

环状RNA全长亚型的识别

FL-circAS从GEO收集了20个细胞系和组织的长读长 RNA-seq（表1），并用isoCirc和CIRI-long来识别环状RNA全长（图 2）

表1. FL-circ中包含的nanopore测序数据

图2. FL-circAS的构建流程图

案例解析同一BSJ的多个isoforms

第一个案例是TEME138基因来源的环状RNA chr11|61366045|61367998|+，它包含3个具有同样BSJ的isoforms（定义为iso#001、iso#002、iso#003），这些isoforms已在Hela细胞中被RT-PCR和Sanger测序验证。关于该BSJ，FL-circAS总共识别到了214条isoforms，而iso#001、iso#002、iso#003在所有isoforms中具有最多的长读长数据支持。值得注意的是，GENCODE中并没有iso#002、iso#003的外显子注释（图 3A,B)；因此，一般短读长测序只能推测出iso#001。从数据库我们可以看到，iso#001主要在HEK293T、brain和testis表达，而iso#002主要在HEK293、adipose、adrenal gland和kidney中表达，另外二者同时在blood中高表达（图 3C）。

图3. BSJ:chr11|61366045|61367998|+(host gene:TMEM138)案例

第二个案例是来源于VAPB基因的chr20|58438945|58441083|+，该BSJ在MCF-7细胞中具有很高的AS信息熵，包含两个高表达的 isoforms（iso#001、iso#002），其中iso#001与 VAPB的外显子一致，而iso#002却存在外显子跳跃（图4E~G）。该BSJ没被验证过，因此，作者对 MCF-7细胞进行RNase R处理，发现该BSJ能够耐受RNase R（图4H）；通过PCR-Sanger测序证实了两个isoforms的存在（图4I，J）。

图4. BSJ：chr20|58438945|58441083|+（host gene:VAPB）案例

以上结果再次证明了许多BSJ内部序列是存在AS事件的，而长读长测序是检测环状RNA全长和可变剪切异构体的有效手段。

FL-circAS这个全长环状RNA数据库，不仅多方面刻画了BSJ不同的可变剪切亚型，还提供了circRNA详细的功能和调控信息，这为广大的环状RNA研究者提供了丰富有用的资源。

原文链接：

https://doi.org/10.1093/nar/gkad829

本期特邀湖南大学彭友松教授团队分享解读，感谢对circRNA平台的关注！

病毒是一类微小而具有传染性的病原体，其基因组相对于真核生物的基因组来说异常微小。正是这种微小的基因组使得病毒circRNA长期以来鲜为人知。与线性RNA不同，circRNA具备独特的封闭环结构，这一特性使其极其稳定，能够抵抗核酸外切酶的降解作用。同时，circRNA广泛分布于各类生物体中，包括植物、动物和病毒。近年来，高通量测序技术和生物信息学工具的发展，使得研究人员能够更全面地识别和分析circRNA。

有研究表明，病毒circRNA在宿主的多种关键生命活动中发挥重要作用，包括调节宿主基因表达、与细胞成分相互作用以及影响宿主免疫反应等方面的影响。比如Sekiba等人发现乙型肝炎病毒（HBV）产生的circRNA与人类DExH-Box螺旋酶9（DHX9）相互作用，参与针对DNA病毒的先天性免疫反应；Liu等人发现，人类γ疱疹病毒4（HHV4）编码的名为circRPMS1的环状RNA可作为miRNA海绵，促进HHV4相关上皮肿瘤的发展。然而，这些病毒环状RNA研究比较零散，且只揭示了少数的病毒环状RNA分子。为了系统地研究病毒circRNA分子，我们之前的工作中建立了首个病毒circRNA数据库VirusCircBase（http://www.computationalbiology.cn/ViruscircBase/home.html）。该数据库近三年来已经被来自全球60个主要国家和地区的用户使用，促进了病毒环状RNA分子的研究。

2023年9月19日，湖南大学彭友松教授研究团队在Emerging Microbes & Infections（IF=13.2）在线发表了的最新研究成果，题为“An updated database of virus circular RNAs provides new insights into the biogenesis mechanism of the molecule”。在先前的研究中，我们建立了首个病毒circRNA数据库VirusCircBase，并在该领域得到了广泛应用。在更新版本的数据库–VirusCircBase 2.0（http://computationalbiology.cn/VirusCircBase2/#/home）中，我们不仅显著增加了数据库中的数据量和功能，还为病毒circRNA的生成机制提供了新的见解。

亮点

1. VirusCircBase 2.0在数据量和功能上都有了显著的提升，包含来自43个病毒物种的60,859个circRNA，为研究人员提供了全面的资源。

2. 病毒circRNA表现出普遍的低表达和较强的组织异质性。

3. 病毒circRNA展示了与动植物不同的独特剪接信号特征。

4. 揭示了与病毒circRNA形成相关的人类基因，为病毒circRNA的生物合成机制提供了启示。

研究结果

01 数据库更新情况：

与前一版本相比，VirusCircBase 2.0在数据量和数据库功能方面都有所更新（表1）。

在数据方面，VirucCircBase 2.0中病毒circRNA的数量从 46440 个增加到 60859 个。具体来说，病毒种、宿主、组织或细胞类型、样本量、病毒circRNAs与宿主miRNAs之间相互作用的数量分别从23、9、46、337、30818增加到43、22、83、566、72157。此外，新增了1902个全长病毒circRNA。

在数据库功能方面，VirusCircBase 2.0提供了三个新功能：i)以热图形式显示病毒circRNA在样本中的表达水平；ii)以基因组浏览器形式显示病毒circRNA在病毒基因组上的表达情况；iii)按宿主浏览病毒circRNA（图1）。

表1. VirusCircBase 1.0和VirusCircBase 2.0的比较

图1. VirusCircBase 2.0的首页截图

该数据库的网址为：

http://computationalbiology.cn/VirusCircBase2/#/home

02 VirusCircBase 2.0包含的数据情况：

我们在6个巴尔的摩分类、25个病毒科和43种病毒中鉴定到了病毒circRNA（如图2所示）。大多数病毒circRNA来自正义单链RNA（ssRNA(+)）病毒（占67.3%）和双链DNA（dsDNA）病毒（占30.6%）。另外，在VirusCircBase 2.0中新增了35种病毒的circRNA，其中20种是之前没有的病毒。其中SARS-CoV和HHV1的circRNA数量增加最为显著，分别从4157个增至9324个和从379个增至2721个。有趣的是，Mammalian orthoreovirus（MRV1）编码了125个circRNA，是目前为止是唯一已知具备编码circRNA能力的dsRNA病毒。此外，我们还发现了两种噬菌体，即假单胞菌病毒PhiKZ（PhiKZ）和埃希氏菌病毒P1（PhageP1），它们分别编码了249个和178个circRNA。

图2. VirusCircBase 2.0中每种病毒中检测到的病毒circRNA数量

03 病毒circRNA在不同细胞或组织中的表达量情况：

由于数据有限，大多数病毒只在少数细胞或组织中表达circRNA。此外，它们在这些细胞或组织中的表达量也很低。病毒circRNA在不同细胞或组织中的表达量差异很大，例如，HHV8在大多数细胞中的丰度较低（lg RPM：2.16-3.79），但在TREx-BCBL1RTA和iSLK-BAC16细胞中的丰度较高（lg RPM分别为4.59和4.97）。有趣的是，一些病毒，如鼠乳头瘤病毒1型（MmuPV1）只有尾部组织中才有高表达的circRNA（lg RPM：6.0），这表明病毒circRNA在MmuPV1尾部组织的慢性感染中起着重要作用。

图3. 病毒circRNA在不同宿主的不同组织或细胞中的表达

04 病毒circRNA的形成机制分析：

如图4A所示，70%的病毒circRNA使用GT/AG剪接信号，这也是动物和植物中使用的主要信号。然而，与非规范剪接信号所占比例低于1%的动物和植物相比，病毒circRNA表现出更高的非规范剪接信号比例。例如，GC/AG信号是病毒circRNA中最丰富的非规范信号，占总数的7.1%，远高于哺乳动物（0.7%）。

对病毒circRNA的剪接类型的分析发现，病毒circRNA中最常见的是A5SS类型（55.9%），其次是ES（22.0%）和A3SS（15.7%）（图4B）。而在人类中，ES是最常见的剪接类型，其次是A3SS和A5SS。

对病毒circRNA的异构体数量的分析发现，大多数病毒circRNA只有一种或两种异构体（69.9%）（图4C）。只有很小一部分病毒circRNA有五个及以上异构体。而在哺乳动物和植物中，circRNA通常有两种或两种以上的异构体。

图4. 病毒环状RNA形成机制分析

05 影响病毒circRNA产生的宿主基因

我们通过计算病毒circRNA的丰度与人类基因表达水平之间的相关性，发现分别有411和755个人类基因与病毒circRNA的产生呈中度正相关或负相关（定义为SCC的绝对值大于或等于0.3）。先前的研究表明，RBPs经常参与circRNA的产生。它们既能促进也能抑制病毒circRNA的生物生成。有趣的是，43个RBP编码基因与病毒circRNA的产生呈中度相关，其中大部分（42/43）呈显著负相关。

功能分析显示，正相关基因富集于有限的功能中，如腺体发育和伤口愈合的生物过程、受体活性和细胞外基质的分子功能。因此，我们重点研究了与病毒circRNA生成负相关的755个基因的功能。这些基因中分别富集了细胞组分（CC）、生物过程（BP）和分子功能（MF）的85、264和26个GO术语，以及14个KEGG通路。CC主要与纺锤体、染色体区、剪接体复合物和核糖体有关（图5A）；BP主要与细胞周期和RNA处理有关（图5B）；MF主要与催化活性、核酸酶活性、微管蛋白和微管结合有关（图5C）；富集的KEGG通路主要与细胞周期、核糖体、COVID-19、剪接体、卵母细胞减数分裂、RNA降解等有关（图5D）。

图5. 与病毒circRNA产生呈中等负相关的人类基因富集的结果

结论

本研究显著提高了数据库的数据量和功能，从而将数据库重建为VirusCircBase 2.0（http://computationalbiology.cn/VirusCircBase2/#/home）。病毒circRNA的表达分析显示，它们在大多数细胞或组织中的表达水平较低，表现出较强的表达异质性。病毒circRNA的剪接分析显示，它们与动植物相比，使用了更高比例的非经典反向剪接信号，并主要使用了A5SS。大多数病毒circRNA没有超过两个异构体。最后，对与病毒circRNA产生相关的人类基因进行研究发现超过1000个人类基因与病毒circRNA的表达呈中等相关性。其中大多数显示出负相关性，包括42个编码RNA结合蛋白的基因。它们在与细胞周期和RNA加工相关的生物过程中显著富集。总的来说，该研究为进一步研究病毒circRNA提供了有价值的资源，也为病毒circRNA的生物合成机制提供了新的见解。

原文链接：

https://doi.org/10.1080/22221751.2023.2261558

详情请访问：circRNA-disease数据库与计算工具盘点

2023年8月16日，西安交通大学付来义团队发表在 Briefings in Bioinformatics （IF=9.5）的文章【KGETCDA: an efficient representation learning framework based on knowledge graph encoder from transformer for predicting circRNA-disease associations 】打破了这个尴尬的局面。

研究团队开发了一个用于预测 circRNA-disease关系的深度学习方法 KGETCDA(Knowledge Graph Encoder from Transformer for predicting CircRNA-Disease Associations)。整合了10多个非编码疾病关系数据库，构建了circRNA、miRNA、lncRNA与疾病的关系数据集，根据该数据集构建了生物学知识图；然后构建了Transformer（继CNN和RNN之后又一个高效的特征提取器）知识提取图层，精确地捕获高阶的交互信息；最后多层感知器被用来预测circRNA-disease associations(CDAs)。

经过评估，KGETCDA比其他最新的方法性能都要优越。

图A.AUC比较

图B.AUPR比较

图C.准确评估数量比较

最后，为了让大家享受到自己的研究成果，作者还开发了一个用户友好的网络平台HNRBase（网址：http://lab-fly.site/KGETCDA）。下图展示了网络平台的一些功能。