近日，北京大学生命科学学院魏文胜教授在Nature Biotechnology杂志在线发表文章Engineered circular ADAR-recruiting RNAs increase the efficiency and fidelity of RNA editing in vitro and in vivo。研究强调了arRNA对剪辑编辑效率的重要性，解决了制约LEAPER系统发生的线性arRNA不稳定的问题，运用可招募ADAR的环形RNA（circular ARAR-recruiting RNA, circ-arRNA）实现了编辑效率提升。

作者研究发现，LEAPER中arRNA的表达丰度对编辑效率至关重要，且5’帽和3′ poly(A)尾巴不会对效率产生干扰。相较于CMV启动子，U6启动子在表达circ-arRNA方面具有更高的效率。

Circ-arRNA相对于线性的arRNA具有更高的稳定性，可以避免核酸内切酶的切割。随后，作者探索了circ-arRNAs是否能对内源性转录本进行有效的靶向RNA编辑。如图1所示，在20个内源转录本位点中，排除3个位点可能存在结构干扰外，其中17个位点的circ-arRNAs编辑效率高于相应的线性arRNA平均3倍以上，编辑效率可维持13天以上。作者使用腺相关病毒(AAV)将circ-arRNAs传递到HEK293T细胞、人原代肝细胞和人大脑类器官，实现了circ-arRNAs对内源转录本高效、持久的RNA编辑。该结果在T4连接酶体外合成的circ-arRNA中得到了验证，结果实现了更加高效的靶向编辑（相较arRNA效率提高5倍以上），与遗传编码的circ-arRNA具有类似的特征。

图1. Circ-arRNAs对内源性转录本进行高效、持久的可编程RNA编辑

邻近碱基的脱靶编辑（bystander off-target editing）是实现更加精准的单碱基编辑，以及体现技术高度特异性的关键。作者通过转录组分析，验证了circ-arRNAs的编辑特异性。在293T细胞中转染circ-arRNA151-PPIA进行全转录组分析发现，与对照组相比circ-arRNA151-PPIA转染组的脱靶编辑数更少。

ADAR蛋白的底物为双链RNA，靶向RNA与circ-arRNA形成的双链区域内的腺苷酸会有不同概率的脱氨风险[2]。如图2所示，基于这种催化反应的特性，作者发现在线性arRNAs或环形arRNAs中删除靶向腺苷对面的核苷酸时，靶向RNA编辑完全被消除了。因此，作者通过删除circ-arRNA覆盖区域中与不需要的腺苷相反的核苷酸，减少临近碱基的脱靶编辑。

图2. 工程化的circ-arRNAs减少脱靶编辑

综上所述，LEAPER 2.0具有更大的应用潜能。工程化的circ-arRNAs可以提高TP53W53X转录本的靶向编辑率。使用scAAV将circ-arRNA递送至Hurler综合征疾病模型小鼠体内，可以成功修复Idua致病突变并恢复IDUA的酶催化活性。总的来说，LEAPER 2.0能够实现精确、高效的RNA编辑，广泛适用于治疗和基础研究。

延伸阅读

值得注意的是，Nature Biotechnology同一期刊登了美国加州大学圣迭戈分校Prashant Mali 教授的文章Efficient in vitro and in vivo RNA editing via recruitment of endogenous ADARs using circular guide RNAs，研究设计cadRNAs来招募内源性ADAR，极大地提高了可编程RNA编辑的效率和持久性。cadRNAs为RNA编辑提供了一种有趣的模式，但在一些方面值得进一步研究：

1. 编辑框架的针对性优化；

2. 将额外的ADAR招募域耦合到cadRNA上也可能进一步帮助提高编辑产量；

3. 通过碱基修饰提高 cadRNA 功效；

4. RNA（i）干扰效应的产生；

5. 长反义链对靶mRNA翻译蛋白的影响；

6. 长时间cadRNA积累的影响。

背靠背文章链接：https://www.nature.com/articles/s41587-021-01171-4.pdf

两篇背靠背文章分别发掘了可招募ADAR的环形RNA，能够提高RNA编辑的效率。不管是LEAPER 2.0系统还是cadRNAs均能够实现精确、高效的RNA编辑。为RNA编辑技术广泛应用于基础研究和治疗提供了指向性的效果。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41587-021-01180-3.pdf

参考文献：

[1]. Qu, L. et al. Programmable RNA editing by recruiting endogenous ADAR using engineered RNAs. Nat Biotechnol 37, 1059-1069 (2019).

[2]. Eggington, J. M., Greene, T. & Bass, B. L. Predicting sites of ADAR editing in double-stranded RNA. Nat. Commun. 2, 319 (2011).

今天Nucleic Acids Research杂志在线刊登了香港城市大学郭駿傑教授的一篇research文章Circular L-RNA aptamer promotes target recognition and controls gene activity。揭示环状核酸适配体比线性适配体更加优异的特性和广阔的应用前景。实现人工合成circRNA适配体的重大技术突破。

研究路线：

郭駿傑教授课题组前期研究开发了一种线性的L-Apt.4-1c核酸适配体，靶向人端粒酶RNA G-四链体(hTERC D-rG4)，并证明其对hTERC rG4核仁素的抑制作用。在各种基于化学或酶的环化方法中，化学反应可以在温和的反应条件下提供高效连接核酸分子的简单方法。铜催化的叠氮烷基环加成反应是这类反应的最佳例子。叠氮化物和炔烃基团通常可以容易地引入核酸，而不影响它们的生物学特性。因此，作者假设环化可以提供一种简单有效的策略来提高非天然左旋核糖核酸适配体的多样性和性能。通过对其课题组前期设计的线性L-Apt.4-1c适配体进行环化处理，进行分子内CuAAC（铜催化的叠氮-炔环反应）反应，将线性适配体5’和3’末端连接。与线性L-Apt.4-1c相比，cycL-Apt.4-1c显示出更强的结合亲和力、更好的特异性和更高的构象稳定性。并使用蛋白质竞争性结合试验、端粒酶重复扩增(TRAP)试验和双荧光素酶报告基因试验首次进一步验证cycL-Apt.4-1c在体外和细胞中的应用前景。

图1 Circ-L-RNA合成

文章链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8287958/pdf/gkab593.pdf

什么是ICBPS（内部碱基互补配对序列）？

研究者利用微阵列在对人血浆中circRNA表达情况进行分析时意外地发现ICBPS（内部碱基互补配对序列）广泛存在于circRNAs中，特别是在超长的circRNAs中（el-circRNAs，>5000nt）。为了进一步验证这个结论，研究者又对人类circRNA数据库进行了分析，结果发现大多数circRNAs的ICBPS最大长度（maxLen）在15nt内（图1a）。接着，作者针对 ICBPS大于20nt的6155个circRNAs进行了分析，发现大多数circRNAs不只有一对ICBPS；且超过2000个circRNAs含有多于20对的ICBPS（图1b）。此外，90%的circRNA，其ICBPS中位长度为20-31nt。最后研究者通过分别对circRNAs长度与ICBPS数量和最大长度进行相关性分析发现ICBPS的数量和最大长度与circRNAs的总长（circLen）密切相关（图1c，1d）。

CR（互补比）的计算

研究者定义了互补比（complementary ratio，CR）的概念， CR= [（maxLen of ICBPS）×2/circLen]×100%。CR越高，预示circRNAs内部碱基配对的可能性越大。然而通过计算数据库中circRNAs的CR，研究者发现，绝大多数的circRNAs其CR低于10％（图1e）。而对于CR高的circRNAs, circLen大部分都低于200nt。为更直观地理解CR这个概念，研究者例举了一个el-circRNA：hsa_circ_0000527。如图所示，hsa_circ_0000527全长6071nt，有3对ICBPS，其中最长的一对（红色显示）是123nt，所以CR =（123×2/6071）×100%= 4.05%。

ICBPS在circRNAs中的特点

另外，研究者计算了亲本基因不同区域转录出的circRNAs的ICBPS情况，发现60％源自3′-UTR的circRNAs的ICBPS≥20nt（图1g）。接着研究者对不同的染色体起源以及来自亲本基因的不同成分进行了相似统计分析（图1h）。

circRNAs可作为ceRNA通过MRE（miRNA recognition elements ，miRNA应答原件）竞争性结合miRNA。在对206个ICBPS的maxLen大于100nt的circRNA进行分析，发现其中64%具有MRE。

同时， 具有内部核酶进入位点（IRES）的circRNAs包含有翻译蛋白质的潜力，这可以通过对其开放阅读框（ORF）的生物信息学分析来预测。于是研究者基于circBank数据库，发现ICBPS≥20 nt的6155个circRNAs，23%ORF以及92%MRE与ICBPS有重叠（图1i）。

circRNA中双链结构具有“打开”和“关闭”两种状态

综合以上分析结果，研究者推测circRNAs可能不是简单的圆环结构。由于ICBPS的存在，它内部可能包含双链结构（在图2a中显示为A和A’）。此外，还可能存在一些特殊情况。例如，可能有一部分ICBPS可与多个ICBPS互补配对（在图2a中显示为B和B’/ B’）。或对于一个连续序列，它可能具有彼此靠近或重叠在同一RNA链上的不同互补序列（在图2a中显示为C，D和C’，D’）。因此，研究者推断circRNAs中双链结构的“打开”或“关闭”状态是一个复杂的动态过程。

双链结构的形成使circRNAs在空间中受到压缩，这可能有助于RNA结合蛋白（RBP）与circRNAs的结合更为牢固，从而促进circRNAs从细胞核输出到细胞质中（视频截图1）。circRNAs形成双链结构的过程或许是可逆的，如上述的circRNAs出核后再“打开”双链结构，从而进一步行使其相关功能。此外，circRNAs高度稳定，外界尚未阐明circRNAs的降解机理。研究者推测circRNAs中的双链结构可能会使它们更容易被相关酶降解，这或许可以解释细胞如何“清除”circRNAs（图2b）。而这一动态过程受微环境（氧含量，温度等）或其他内部因素（ICBPS的长度，结合自由能，配对片段之间的距离，RNA的二级结构或RNA修饰）调节，调控circRNAs出核、翻译、降解。另外需要强调的是，当circRNAs的相关位点由于碱基配对的发生而被“封闭”时，circRNAs作为miRNA的海绵及其转录后调控行为将会受到阻碍（视频截图2）。同时，由于某些circRNA可以通过核糖体进行翻译，但当circRNA中的相关位点由于碱基配对的发生而被“封闭”时，这种情况将会被阻止（视频截图3）。

实际上，一些研究对ceRNA的机制提出了质疑：某些circRNA被预测能够结合特定的miRNA从而调节下游靶基因，而这一预测不能通过相关实验得到很好地证明。另一方面，某些circRNAs的丰度变化无法有效地调控目标基因。基于这种现象，作者提出了特定circRNAs从正常状态向病态过渡的“开-闭效应”假设：对于那些具有封闭ICBPS的circRNA，即使它们高表达，也可能发挥不了相应的生物学功能；对于那些表达相似甚至更低的circRNA，它们也可能通过“开放”相关的ICBPS发挥重要作用，反之亦然（图2c）。

讨论

综上所述，作者推测circRNA可能不是一个简单的环状结构，其内部可能含有双链结构，双链结构的“开”或“闭”是一个复杂的动态过程。如果这一假设是正确的，则说明circRNA在疾病的发生和发展中的作用不一定是通过其异常表达实现，也可能是通过序列上相关位点的“开-闭效应”。如果某个circRNA同时具有致癌和抑癌miRNA结合位点，那它可能选择性地“打开”或“关闭”特定miRNA结合位点，因此起到不同的作用。此外，该模型可能有助于为以下问题提供新的思路和证据：1）某些circRNA无法使用根据引物设计原则设计的引物进行扩增和验证；  2）为什么某些circRNA对它们的预测靶标miRNA没有影响；  3）circRNA如何从细胞核输出到细胞质中（特别是el-circRNA）；  4）circRNA是如何被降解的；  5）m6A如何调节circRNA编码蛋白质；  6）有助于加强对el-circRNA的功能研究。该假设可能会改变现有的circRNA研究模式，更重要的是，将改变基于测序进而筛选出表达异常circRNA，作为潜在研究指标的基本逻辑认知。

参考文献

1. Handong Sun. et al. CircRNA may not be “circular”; bioRxiv 2020.09.27.315275 (2020).

免疫代谢类疾病已成为重大的公共健康问题，与高能量摄入和久坐有关，常带有炎症特征，包括非酒精性脂质性肝炎（NASH），糖尿病，肥胖等等。代谢紊乱如何导致不可控制的炎症状态的机制目前还没有很好的解决。在脂质暴露的肝脏成纤维细胞中，作者发现了线粒体来源的ROS与促炎症表型有关。结合芯片分析的circRNA表达谱，发现了三个线粒体来源的在NASH中显著下调的circRNA分子。作者利用开发的靶向线粒体的mito-NP递送系统，过表达三个circRNA看对ROS生成和胞质/线粒体ROS量的影响情况，最终确定hsa_circ_0089762与NASH中线粒体ROS释放有关，基于后期的研究结果，作者将该circRNA命名为SCAR。SCAR直接与ATP5B相互作用，阻止ATP5B与CypD的结合并抑制mPTP的开放，进而抑制线粒体ROS的释放。利用线粒体靶向递送系统表达SCAR能抑制NASH的促炎症表型。动物模型和临床标本实验进一步验证了这些现象和机制（[1]）。下面我们就一起学习一下本文的主要内容：

 1、线粒体ROS介导脂质暴露后成纤维细胞的促炎症表型

作者分离NASH和对照患者肝脏成纤维细胞，SeaHorse检测代谢指标OCR和ECAR，结果显示NASH患者肝脏成纤维细胞OCR和ECAR均升高，并且ECAR/OCR的比值在NASH患者中也升高。Palmitate处理正常成纤维细胞也有相似的变化情况。这说明脂质暴露可诱导成纤维细胞ATP生成方式从线粒体TCA循环和氧化磷酸化为主转变为胞质糖酵解为主。JC-1检测线粒体跨膜电势结果显示，NASH肝脏成纤维细胞中跨膜电势显著降低。透射电镜结果表明NASH肝脏成纤维细胞线粒体呈现肿胀状态（Swell）。线粒体在应激状态往往会表现出ROS增高的情况，为检测出ROS在胞质（cROS）和线粒体（mROS）中的含量，作者选择了两种检测的技术方法：一种是荧光探针法，mitoSOX可特异性显示线粒体中ROS的含量，DCFH-DA可特异性检测胞质中ROS的含量；另一种是转染不同定位的ORP蛋白，ORP蛋白是一种ROS敏感的蛋白，可以通过测定405/488 nm 荧光比值测定ROS含量，分别将特殊定位信号融合可介导胞质（cytoORP）和线粒体（mitoORP）定位。两种方法均显示，NASH肝脏成纤维细胞cROS和mROS均升高。Palmitate处理正常成纤维细胞也有相同的变化。已知线粒体中ROS可以通过mPTP通道渗透至胞质中，这可能也是胞质ROS的主要来源。mPTP抑制剂cyclosporine A处理后在NASH肝脏成纤维细胞和Palmitate处理正常成纤维细胞中cROS均降低，说明上面检测到的ROS升高主要是线粒体来源的mROS生成增高所致，mPTP孔的开放促进了cROS的增高。ROS介导了很多的免疫细胞活化，但在成纤维细胞活化过程中的作用还没有相关的研究。ROS抑制剂（mitoTEMPO和DPI）可抑制NASH肝脏成纤维细胞收缩性，抑制I型和III型胶原及α-SMA的表达，一些炎症相关因子表达也显著下降，包括IL-1β，IL-8，TNF-α，CCL-2。这些数据说明mROS介导了成纤维细胞脂质暴露后的一些促炎症表型。

图1  mROS与NASH肝脏成纤维细胞促炎症表型 （[1]）

 2、脂质暴露改变线粒体circRNA表达谱

成纤维细胞中circRNA的认识还非常有限，为了进一步探索上面发现的这些现象，作者收集了NASH和健康对照的肝脏成纤维细胞各4例，进行circRNA的芯片检测。NASH组显著下调的circRNA分子中线粒体DNA来源的circRNA比较靠前，一共分析到了4个线粒体DNA表达的circRNA，其中有三个是表达下调显著的。分离胞质和线粒体组分的实验也验证了这三个circRNA的定位，均为线粒体定位。

图2  NASH肝脏成纤维细胞线粒体circRNA表达下调 （[1]）

 3、hsa_circ_0089762（SCAR）显著降低NASH肝脏成纤维细胞cROS

细胞中线粒体靶向递送是非常有挑战的技术难题，作者设计了一种特殊的pH敏感的线粒体靶向递送纳米颗粒（mito-PN），该系统可以实现特异性的将circRNA过表达载体输送至线粒体中。mito-PN颗粒被细胞内吞后进入内含体，其中的酸性环境导致mito-PN外层的包裹物质子化和解离，释放内层的线粒体靶向多肽TACP，最终实现将所包裹的质粒输送至线粒体中。为验证mito-PN靶向线粒体递送的效率，作者用lipo-3000作为对照，比较输送GFP表达载体在线粒体中靶向递送的效率。3D成像的数据显示，lipo-3000仅有12%左右的GFP信号与线粒体是共定位的，而mito-PN的线粒体定位效率可达90%。利用这一递送体系，作者发现过表达hsa_circ_0089762可显著降低NASH肝脏成纤维细胞cROS的升高，另外两个circRNA的一个不能通过mito-PN表达和递送（分子太大），另一个没有明显的效应。后面作者就将hsa_circ_0089762作为研究的目标分子，并根据其作用机制将其命名为SCAR（steatohepatitis-associated circRNA ATP5B regulator）。

图3  SCAR抑制NASH肝脏成纤维细胞cROS（[1]）

 4、SCAR定位于线粒体，抑制成纤维细胞活化

FISH检测表明90%的SCAR信号均定位于线粒体，反向引物，RNase R分析，Northern检测鉴定了SCAR的circRNA特性。利用mito-PN系统在NASH肝脏成纤维细胞中过表达SCAR后线粒体膜电势恢复，Palmitate处理正常成纤维细胞也有同样的变化结果。Palmitate处理正常成纤维细胞中过表达SCAR后cROS和mROS均下降。NASH肝脏成纤维细胞中过表达SCAR可有效抑制细胞收缩性，I型和III型胶原及α-SMA的表达，抑制促炎症相关因子的表达，这些表型与ROS抑制的效应相似。

图4  SCAR定位于线粒体，抑制成纤维细胞的活化（[1]）

 5、SCAR与ATP5B相互作用

为进一步分析SCAR的作用机制，作者分别分析了SCAR的ORF和miRNA的结合情况。预测的ORF中在终止密码子前添加3× Flag标签，如果该ORF可被翻译，可以通过WB检测相应的条带，作者在该体系中没有检测到相关的条带，因此没有进行翻译产物的分析。同样的，作者也预测了可能的miRNA结合位点，但没有一种miRNA的结合位点超过两个，并且这些miRNA都不是线粒体表达的，因此作者也没有从miRNA Sponge的角度进行分析。最终，作者通过RNA pull-down捕获了与SCAR的相互作用蛋白，质谱鉴定后发现了ATP5A和ATP5B均可以被捕获。细胞内ATP5A和ATP5B是直接相互作用的，SCAR是否同时与两者相互作用，还是仅与其中一个相互作用？体外纯化两种蛋白后EMSA分析实验表明，SCAR主要与ATP5B相互作用。不同线粒体定位的APEX标记体系显示，SCAR与ATP5B主要在线粒体基质中相互作用。序列分析表明，SCAR的100-182有颈环结构，删除突变实验表明SCAR主要通过这一段与ATP5B相互作用。之前的一项蛋白质谱研究数据显示ATP5B中的一段肽序列可能是与SCAR相互作用的位置，突变实验证明了这一段肽段与SCAR的相互作用有关。

图5 SCAR与ATP5B相互作用（[1]）

 6、SCAR结合ATP5B阻断与CypD的相互作用，抑制成纤维细胞活化

mPTP通道的开放与线粒体膜电势降低和ROS升高有关，ATP5B是一种mPTP通道的调节蛋白，因此作者进一步探索了SCAR与mPTP通道的关系。Calcein释放分析可检测mPTP通道的开放，分析显示Palmitate处理正常成纤维细胞可显著释放calcein，而过表达SCAR后该效应消失，单过表达ATP5B结合位点的SCAR没有这种效应。CypD可以通过结合APT5亚基调控mPTP通道的开放，是否SCAR是通过影响CypD与ATP5B的相互作用而影响了这一过程？分别过表达SCAR野生型和突变型后Palmitate处理，CoIP分析CypD与ATP5B的相互作用情况，结果显示，过表达野生型SCAR能显著抑制两者的相互作用，而过表达突变型的SCAR没有这种效应。JC-1检测跨膜电势，cROS检测及细胞收缩性，I型和III型胶原及α-SMA的表达，抑制促炎症相关因子的表达检测结果表明，SCAR与ATP5B的相互作用阻止了CypD与ATP5B的相互作用，进而抑制了mPTP的开放，并进一步抑制了成纤维细胞活化的作用。

图6  SCAR结合并抑制CypD与ATP5B相互作用，抑制成纤维细胞活化 （[1]）

 7、脂质暴露诱发ER Stress，通过CHOP抑制PGC1α和SCAR表达

SCAR由线粒体的轻链表达，它的来源基因是JA760600，已知一些核基因组编码的剪切相关的因子能进入线粒体并介导RNA的剪切，包括eIFA3，7种hnRNP蛋白。siRNA分析表明hnRNPM介导了SCAR的生成，其他蛋白的siRNA没有明显的效应。CLIP实验数据也证明了hnRNPM在SCAR侧翼的结合位点。RNase L可介导circRNA的降解，干扰RNase L后能显著抑制SCAR的降解。脂质暴露可导致成纤维细胞中SCAR的表达，为分析介导这一过程的因子，作者首先分析了SCAR和来源基因JA760600的转录因子位点，发现在上游-25~-18的位置有PGC1α的结合位点，ChIP实验验证了结合位点，Palmitate处理后PGC1α结合下降，干扰PGC1α也可抑制SCAR的表达。脂质暴露可诱导ER stress，进而诱导CHOP抑制PGC1α的表达。作者在 NASH肝脏成纤维细胞中检测了这些标志基因，Palmitate处理后干扰CHOP可恢复PGC1α的表达，并进而恢复SCAR的表达水平。这些数据表明，SCAR受到PGC1α的调控，脂质暴露后诱发ER stress，进而诱导CHOP上调，抑制PGC1α，进而导致SCAR的表达下调。

图7 脂质暴露诱发ER Stress，通过CHOP抑制PGC1α和SCAR表达（[1]）

 8、SCAR缓解高脂饮食诱导小鼠肝硬化

小鼠中没有SCAR的同源产物，但小鼠的Atp5b与人的ATP5B高度同源，预实验表明SCAR可以与小鼠Atp5b相互作用。预实验也表明mito-PN可以在小鼠肝脏中实现有效的线粒体递送。因此可以借助该递送系统探索小鼠中过表达SCAR的效果。结果显示，过表达SCAR能够显著缓解高脂饮食诱导的肝硬化表型。

图8 小鼠中过表达SCAR抑制高脂饮食诱导的肝硬化（[1]）

 9、临床标本中SCAR与肝脏脂肪变性到NASH的转变过程相关

为分析SCAR在临床标本中的表达与临床表型的关系，作者利用FISH检测分析了SCAR在NAFLD标本中的表达情况，结果显示，SCAR的表达状态与肝硬化评分和DHE阳性肝成纤维细胞比例显著负相关，健康肝组织，轻度肝脏脂肪变性，NASH轻度纤维化和NASH肝硬化的标本中SCAR的表达依次递减。这些数据表明SCAR的表达状态与NASH病变过程高度相关。

图9 临床标本SCAR表达与NASH疾病进程显著负相关（[1]）

本文从发现SCAR在NASH中表达下调，依次分析了SCAR的作用机制，生成机制，直到小鼠模型和临床标本验证，系统揭示了SCAR在NASH中的表达状态和功能机制。SCAR是线粒体来源的circRNA，作者开发的mito-PN体系有效的解决了线粒体中特异性递送和表达外源circRNA的技术问题，为线粒体来源circRNA的功能研究提供了借鉴，也再次证明circRNA是一类功能强大的分子，未来依然有很多值得探索的科学和临床问题。

参考文献

1. Zhao et al., Targeting Mitochondria-Located circRNA SCAR Alleviates NASH via Reducing mROS Output, Cell (2020), https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.08.009