目前，环状RNA药物表达蛋白质的主要方式是通过在其序列中插入病毒来源的IRES（内部核糖体进入位点），以启动下游蛋白编码序列的翻译。研究表明，IRES的筛选以及其邻近序列的优化能够显著提升环状RNA的翻译效率。然而，目前尚缺乏针对特定细胞类型，尤其是免疫细胞，进行高效IRES筛选的研究。此外，尚未有研究通过精确解析IRES的三维结构来进一步优化其功能。在环状RNA药物开发中，IRES的细胞特异性优化和结构功能研究仍具有很大的探索空间。

该研究中，研究团队筛选了29种IRES元件，发现肠道病毒A（EV-A）的IRES在小鼠和人的不同免疫细胞系均表现出最高的翻译效率，表明其是一个适应性强且高效的 circRNA 翻译元件。

此外研究利用SHAPE-MaP技术解析了EV-A IRES的二级结构，并进行靶向突变和截短优化。优化后的IRES不仅结构更加精简和稳定，而且在不同细胞系中均表现出更高的翻译效率。

研究还进一步优化了circRNA疫苗设计，包括筛选出50 nt聚腺苷酸（polyA50）作为最佳的非翻译区序列，并发现通过添加miRNA识别位点，可实现组织特异性调控。

circRNA与线性mRNA在翻译起始机制上存在显著差异，circRNA可能与线性mRNA竞争有限的共同翻译起始因子。然而，编码卵清蛋白（OVA）的circRNA疫苗在稳定性及免疫诱导能力上展现出独特优势，能够更高效地激活树突状细胞，并显著增强T细胞介导的免疫反应。

在B16F10-OVA肿瘤模型中，circRNA疫苗显著诱导了更高比例的抗原特异性T细胞，并展现出卓越的肿瘤预防效果。此外，针对肿瘤新抗原和HPV抗原设计的circRNA疫苗也诱导了更为强大的免疫反应，其抑制

肿瘤生长的效果显著优于线性mRNA疫苗。

编码OVA的环状mRNA疫苗诱导有效的T细胞应答和对B16 F10-OVA肿瘤模型的保护作用

综上，该研究通过筛选高效IRES、非翻译区和miRNA识别位点等序列元件，成功设计并优化了肿瘤抗原circRNA疫苗。优化的circRNA疫苗在体外免疫细胞模型和体内动物模型中均展现出显著优于传统线性mRNA疫苗的T细胞免疫反应水平，并在肿瘤预防和治疗方面表现出强大的功效。这些结果为circRNA疫苗作为癌症治疗新策略的应用奠定了坚实基础，为未来的肿瘤免疫治疗提供了新的方向和思路。

https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC11729565/

在2023年1月，双方曾达成一项合作协议：由先博生物负责对Orna公司利用突破性环状mRNA技术（oRNA）开发的体内细胞治疗产品在大中华区抗肿瘤领域的开发和上市，包括Orna管线最领先的产品anti-CD19 in situ CAR (isCAR)项目，名为“ORN-101”。

先博生物目前布局了6条产品管线，专注于通用型CAR-NK与CAR-T技术的研发，并且拥有成熟的工艺开发技术。此前，先博生物与Orna合作开发的CD19 CAR-NK在一期临床试验已取得积极结果。此次合作新增BCMA靶点，将进一步推动panCAR疗法的发展，使其在多发性骨髓瘤治疗领域更具竞争力。

Orna Therapeutics专注于设计和开发全新一类的完全工程化环状RNA（oRNA^®）疗法，旨在释放RNA 医学的潜力，用于治疗全身各种疾病。Orna的环状RNA转录物相比传统的mRNA方法具有多种优势，包括简化生产流程、优化脂质纳米颗粒（LNP）制剂以及更卓越的蛋白表达能力。其业界领先的基于LNP的递送系统和全面的编辑程序，使Orna有能力推进具有巨大潜力的创新RNA疗法，从而变革患者护理方式。

官网链接：www.ornatx.com

上海先博生物科技有限公司（简称“先博生物”，www.simnovabio.com）致力于为肿瘤及自身免疫性疾病患者带来创新细胞治疗产品。先博生物拥有丰富的研发管线，其技术优势为自主研发的通用现货型CAR-NK和BiTE CAR-T技术平台均处于临床开发阶段。

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.11.21.624667v1

研究首先使用基于ANT矩阵的滑动窗口从训练数据集中导出最高潜在编码区（HPCR），使用动态规划算法选择最优HPCR（图1）。随后，从阳性组和阴性组中提取最佳HPCR或转录本的序列、保守性、结构和机制特性，并将其纳入RF模型进行训练。训练完成后，即可预测circRNA的编码潜力。通常，CICADA使用全长circRNA序列作为输入，输出具有或不具有编码潜力的circRNA的二进制结果。接着，研究使用了一种创新的方法，通过HPCR识别潜在的circRNA编码产物（circProt）（图2）。CICADA基于翻译组学或蛋白组学的证据支持，可以获得高通量、可靠的circRNA编码产物。与多种预测方法相比，CICADA在预测circRNA的潜在编码和编码产物方面呈现出高性能。

图1 CICADA工作流程。

图2 从circRNA的HPCR中鉴定circRNA编码蛋白产物的策略。

CPC2和CPAT是目前广泛使用的评估RNA编码潜能评估工具，研究对比了CICADA和上述两种工具的性能，分别在circPro和circBank中预测circRNA的蛋白质编码潜能。此外，主要为线性转录本设计的CNCI作为软件的基线版本。结果表明，CICADA方法的准确率最高，误差率最低；CPAT灵敏度和召回率最高，而特异性和精密度最低；CNCI的特异性和精密度最高，但灵敏度和召回率较低。值得注意的是，CICADA在F1评分、几何平均(GM)和马修斯相关系数(MCC)方面优于CPAT、CPC2和CNCI。此外，与基于混淆矩阵的其他三种方法相比，CICADA表现出更优越的性能。

CircPro需要对每个样本进行RNA-seq和ribo-seq数据的匹配，CircCode依赖ribo-seq数据，CICADA只需要RNA-seq数据。对比验证结果表明，CICADA是预测circRNA编码潜力的一种经济有效的算法。(图3)

图3 评估CICADA预测性能。

CICADA还可以预测潜在的circRNA编码产物（circProt）。研究使用CICADA和ORFfinder，并匹配的蛋白质组学数据，对食管癌细胞系中的circRNA翻译概况进行研究。基于已知蛋白，与ORFfinder相比，CICADA鉴定出更多新的circRNA编码产物。（图4B）

研究从串联质量标签(TMT) 11-plex标记和Label Free（LF）样品中搜索匹配的原始MS蛋白组数据，寻找可能的肽(图4C)。结果表明，CICADA预测结果中有MS数据支持的circProt明显多于ORFfinder，特别是在LF样本中。

研究还分析了使用CICADA预测的可翻译circRNA和circProt的分子特征。利用psirc生成的这些circRNA的完整序列，鉴定出202,799个可翻译的circRNA，其中4,955个有MS数据的支持(图4D)。这些可翻译的circRNA可分为三种类型：通过滚动环机制进行翻译的；可以在不跨越circRNA连接位点或滚动的情况下翻译成蛋白质；跨越circRNA连接位点但不通过滚环进行翻译的。

图4 评估CICADA预测性能。

研究利用circRNA-seq分析10个ESCC细胞系和两个正常食管细胞系中circRNA，得到ESCC差异表达的circRNA有355个。使用CICADA预测这些circRNA，鉴定出222个具有编码潜能的circRNA，并用MS鉴定了其中4个circRNA的翻译产物。

使用CICADA预测可翻译的circRNA，并挖掘circProts。通过NetMHCpan检测，大多数circProts具有新抗原潜能(图5D)，也鉴定出了一些高频新抗原肽序列(图5E)。随着circRNA编码产物长度的增加，新抗原的数量也随之增加(图5F)。大多数这些功能可翻译的circRNAs起源于染色体3和17的CDS。

图5 CICADA鉴定ESCC中功能性可翻译circRNA。

研究使用CICADA，预测了各种癌症类型中可翻译的circRNA，并在MS数据中挖掘circProt(图6B)。大多数这些可翻译的circRNA含有mRNA重叠的区域，特别是在CDS内(图6C)。大多数circRNA的翻译没有跨越环化位点或滚动的情况下进行翻译；可翻译circRNA及其产物集中在1000 nt的范围内(图6D)。相当大比例的circRNA进行滚环翻译或跨越环化位点但未滚环的翻译。这两种翻译机制都产生了新的蛋白质产物(图6E)。GO分析显示，大多数基因与蛋白质结合或酶活性有关(图6F)。

图6 使用CICADA对泛癌的可翻译circRNA进行分析。

将可降解的连接物如酯键结合到脂质尾部，可以降低免疫原性，促进mRNA释放，并改善mRNA表达。此外，有报道称尾部支化的脂质可以加速它们从核内体中逃逸。^[7,8]

研究通过Michael加成反应合成一系列具有多个酯键的可电离脂质，利用1H NMR光谱验证结构。将这些可电离脂质与辅助脂质、胆固醇、DSC和DMG-PEG一起配制成LNP，并保持与商用Dlin-MC3-DMA脂质(MC3)相同的摩尔组成和氮磷比(N/P)进行RNA包封。其中，AX4-LNP与商业化ALC0315-LNP和SM102-LNP相比，在IM给药后诱导的蛋白表达相似，展现最有效的mRNA递送效果。（图1）

图1 体内筛选脂质用于mRNA递送。

研究进一步发现，脂质的尾部结构对mRNA表达有显著影响，AX4脂质（含有四个分支尾部）比AX4-2和AX4-3（分别含有两个和三个分支尾部）显示出更高的蛋白表达水平。（图2）

图2 体内筛选具有不同数量X4和不同连接体的脂质用于mRNA递送。

研究评估结果表明AX4-LNP在体内主要为肝脏靶向性（图3）。采用LC-MS/MS法检测AX4-LNP在肝脏和脾脏中的代谢。与MC3-LNP相比，静脉给药后，AX4-LNP在肝脏和脾脏的降解速率要快得多（图4）。此外，接种mRNA疫苗的小鼠无明显的免疫反应和明显的体重变化，进一步证实了其显著的生物相容性。

图3 IM或静脉注射后Fluc cmRNA-AX4-LNP的体内生物分布和蛋白表达。

图4 AX4-LNP的理化、代谢和生物相容性。

研究将野生型SARS-Cov-2 Spike的RBD（残基Arg319−Phe541）与T4纤维蛋白（折叠蛋白）融合，通过柔性GS连接体连接形成三聚体结构(图5a)。为了分泌这种抗原，使用了一种工程化的信号肽secrecon。

研究利用利用包含鱼腥藻PIE系统、Echovirus 29 IRES、间隔区、同源臂和蛋白质编码区的框架编码Delta RBD三聚体(图5c)。体外转录后环化生成cmRNA。并利用制备型HPLC-SEC纯化，产率76%（图5d），环化效率为83%，纯度为89.35%。

图5 设计与制备编码Delta RBD三聚体的cmRNA。

在BALB/c小鼠中进一步评价编码T4 fibritin工程Delta RBD三聚体的cmRNA-1130疫苗的免疫原性和有效性。在小鼠中接种两剂cmRNA-1130可诱导高水平和持久的抗SARS-COV -2NAb，对Delta和其他假病毒变体具有很强的中和活性，并且Delta RBD三聚体诱导的NAb足以阻断假病毒全长刺突介导的细胞转导。cmRNA-1130可以激活Delta RBD/刺突蛋白特异性T细胞，诱导小鼠Th1型特异性T细胞免疫应答。总之，cmRNA-1130可诱导强体液免疫和细胞免疫。（图6）

图6 cmRNA-1130在BALB/c小鼠体内的免疫作用。

cmRNA-1130在4°C持续6个月以及25°C和37°C持续7天后，大小变化、mRNA泄漏和包封率（EE）变化极小。此外，cmRNA-1130能够承受反复冻融过程，在6次冻融循环后，其大小和mRNA包封无明显变化，表现出显著的稳定性。重要的是，cmRNA-1130在4°C下储存6个月或反复冷冻和解冻6次后，在接种后第14天仍显示出与新鲜疫苗相当的NAb水平。cmRNA-1130优越的稳定性有利于mRNA疫苗的有效性和冷链运输。

研究开发了一种新的SARS-Cov-2 Delta变体疫苗（cmRNA-1130），其中编码Delta受体结合域(RBD)三聚体抗原的环状mRNA（cmRNA）由一种新的可生物降解LNP包封。AX4在体内的快速代谢特性可以降低潜在的全身毒性。Delta RBD cmRNA在小鼠体内的成功递送诱导了针对多种变体的强大的中和抗体(NAb)和强烈的T细胞反应。此外，由AX4形成的纳米颗粒在肝脏和脾脏中的代谢速度远快于MC3脂质，相应的疫苗可以在4℃下保存6个月以上。总之，研究表明cmRNA-1130作为直接阻断流行性疾病的预防性疫苗具有巨大的临床潜力。

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.4c20770

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缺血性心脏病是一种由冠状动脉粥样硬化引起的严重心血管疾病，因血管狭窄或阻塞导致心肌供血不足，进而引发心肌缺血甚至坏死。随着全球人口老龄化和生活方式的改变，IHD的发病率持续上升，已成为全球范围内威胁公共健康的主要疾病之一。然而，目前的治疗手段在促进心肌微循环重建和血管新生方面成效有限，迫切需要更高效的新型疗法来改善患者的预后和生活质量。

HM2002注射液是基于环码生物自主创新技术平台研发的新一代环形RNA药物，专为治疗缺血性心脏病设计。该疗法通过在心肌内稳定表达血管内皮生长因子（VEGF），显著促进血管新生与心肌灌注，从而加速心功能恢复。与传统线性RNA相比，HM2002所采用的环形RNA技术具有更高的稳定性和更低的免疫原性，在治疗应用中展现了独特的优势。

2024年8月，上海交通大学附属瑞金医院心脏外科赵强教授团队启动了一项研究者发起的临床试验（IIT），探索HM2002注射液在接受冠状动脉旁路移植术（CABG）的IHD患者中，经心外膜心肌内给药的安全性和初步疗效。至2024年10月，已经完成了全部患者的注射给药。初步结果显示，所有患者均恢复良好，未观察到药物相关的不良事件，心功能较术前均有显著改善。目前，患者随访工作仍在持续进行中。这些研究数据为HM2002注射液的安全性和潜在疗效提供了积极的支持，也为后续的临床试验奠定了坚实基础。

HM2002注射液的NMPA临床试验批准，标志着环码生物在环形RNA药物开发领域迈出了关键一步，同时为中国原创生物技术在高端生物医药领域树立了新的标杆。环码生物将继续深耕环形RNA药物的研发与临床应用，推动HM2002注射液的临床研究进程，并探索环形RNA在其他适应症中的潜力应用，开发更多突破性疗法，为广大患者带来新的希望与福音。

环码生物（CirCode），是全球领先的环形RNA疗法的引领者，先后荣获国家级高新技术企业、上海市专精特新中小企业等多项殊荣。公司基于自主研发的多项关键技术，打造了全链条自主可控的环形RNA技术平台，构筑了完善的全球专利保护体系，为环形RNA药物开发扫清障碍。环码生物从未被满足的临床需求出发，储备管线覆盖多个治疗领域：传染病疫苗、心血管、自身免疫性疾病、肿瘤等。公司凭借自身优势，在产业领域备受瞩目，吸引众多知名投资机构关注，成功斩获数亿元融资，为公司发展注入强劲动力。环码生物已与多家国际知名药企达成合作，共同探索及开发环形RNA疗法的潜力，推动更多以环形RNA技术为疗法的药物的创新。环码生物将持续推动科学技术成就的转化，造福广大病患，让天下没有难治的病。