近年来，circRNA高质量研究热度攀升。作为下一代RNA药物开发的理想平台，聚焦于circRNA的早筛早诊、预后评估、新型疗法、体外合成工艺及包封递送技术等研究，为circRNA从实验室迈向临床提供了有力支撑。
2024年，中国药企率先发力，推动两款国际领先的circRNA药物实现里程碑式的突破。转录本生物（RiboX）用于治疗放射性口干症的RXRG001疗法；环码生物（CirCode）用于治疗缺血性心脏病的HM2002注射液。先后获得美国FDA和中国NMPA的临床试验许可（IND），circRNA疗法取得跨越式进展。
本文将回顾2024年，circRNA从基础研究到临床转化的进展：
基础研究
-
新型靶点的挖掘展示精准医疗潜力
-
生成和转运机制研究提供精准干预策略
-
编码or非编码生物学功能启发新型疗法
-
数据信息及分析工具加速研究进程
转化应用
-
生物标志物研究有望实现早筛早诊及预后评估
-
疫苗/肿瘤免疫/基因编辑等疗法研究成果丰硕
-
提升合成工艺及递送策略加速成药进程
临床进展
-
中国两款circRNA药物进入IND阶段
-
全球管线推进产业升级以加速临床转化
展望
-
circRNA潜力无限且未来可期
基础研究
一 新来源的circRNA
1976年，circRNA分子首次在植物类病毒基因组中被发现，沉寂30余年后，研究者通过高通量测序技术发现其在人体内广泛存在且与生命活动密切相关，circRNA迅速成为备受瞩目的明星分子。自然界中circRNA的种类和复杂性远超人们想象，大量特性和功能仍待探索。2024年，一些新来源的circRNA涌现，为精准医疗靶点挖掘带来新希望。
斯坦福大学Andrew Z Fire团队在人类口腔和肠道微生物组数据中，新发现一类circRNA，命名为“Obelisk（方尖碑）”。Obelisk是介于病毒与类病毒之间的全新元件，可能会改变细菌宿主的基因活动，进而影响人类基因。[1]
推荐阅读：Science：“这太疯狂了！”人类肠道微生物中发现新型病毒实体——被称为“方尖碑”的环状RNA
华中科技大学协和深圳医院肖礼祖联合美国罗格斯大学朱桦和霍华德大学唐七义，采用二代和三代ONT测序在水痘带状疱疹病毒（VZV）及其感染的神经母细胞瘤中，鉴定了一种源自VZV潜伏期相关转录本(VLT)的VZV circRNA（circVLTSlytic）。circVLTSlytic在VZV发病机制中发挥重要作用，可以增强VZV对阿昔洛韦的耐药性，使VZV逃避抗病毒治疗，具有作为优化治疗的靶点和作为药效标志物的潜力。[2]
推荐阅读：吉赛生物ONT三代测序助力circRNA新研究！
二 circRNA的生成及转运
circRNA主要通过反向剪接生成，其过程受多种顺式元件和反式因子调控，这一独特生成过程的精准调控为疾病诊断和治疗提供了新思路。
中国科学技术大学王小林/单革团队发现ZC3H14蛋白可以通过结合成环序列外显子-内含子边界和3’UTR，促进circRNA产生，在雄性生殖中发挥关键作用。深入研究睾丸中circRNA生成机制和功能，有望为不育症的临床治疗提供新的有效治疗策略。[3]
推荐阅读：ZC3H14蛋白可促进约40%的circRNA生成
中南大学朱曲波团队为了增强体内circRNA的生成，利用称为“circRNA促进RNA（cpRNA）”的工具，可以通过补充pre-mRNA中反向互补匹配(RCMs)的侧翼序列，优化外显子环化，从而促进circRNA的形成。cpRNA作为一种极具潜力的circRNA过表达策略，为circRNA表达水平低下引发的疾病提供了有前景的治疗思路。[4]
circRNA转运
circRNA主要在细胞核内生成，大部分转运至细胞质中发挥作用。其出核过程受多种生物学机制调控，动态转运亦影响其功能。circRNA转运机制的揭示为干预circRNA功能的治疗策略提供理论基础。
墨尔本大学Vihandha Wickramasinghe联合阿德莱德大学Gregory Goodall团队发现小分子GTP酶Ran-GTP的梯度，出核受体exportin-2，以及IGF2BP1/2都可调控circRNA的出核。这些分子机制为干预circRNA转运开发疾病疗法提供了可能性。[5]
推荐阅读：环状RNA的出核机制——未来癌症疫苗的一把关键钥匙
随后，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心陈玲玲团队首次发现将circRNA出核调控与功能作用关联。一类腺苷酸富集的circRNA在人源胚胎干细胞H9的细胞核中滞留，并随着定向分化为前脑神经元的过程中出核，其动态定位参与调控蛋白质翻译和神经元的突触生长。[6]
推荐阅读：环形RNA在神经发育过程中转运与功能调控新机制
三 circRNA的生物学功能
图1 circRNA的生物发生及功能[7]
circRNA翻译
circRNA的可翻译性及其翻译产物的功能是近年的研究热点，其可翻译性是其替代线性mRNA成为下一代RNA疗法的前提。circRNA可由内部核糖体进入位点（IRES）、m6A修饰或外显子连接复合物（EJC）等介导翻译起始。
● 翻译机制研究，优化circRNA药物设计
中科院上海生命科学研究院王泽峰团队基于机器学习算法，预测到大量具有翻译激活子活性的潜在RBP，这些激活因子可促进IRES介导的circRNA翻译。特定的翻译激活因子可调控IRES介导的circRNA在不同细胞环境下的翻译。通过设计在特定细胞中启动翻译的IRES，可得到细胞特异性翻译的circRNA，从而达到精准治疗的目的。[8]
推荐阅读：系统预测并鉴定circRNA翻译激活因子，有望用于调控细胞特异性翻译！
缺乏终止密码子的circRNA允许核糖体沿circRNA翻译多次，从而产生多聚蛋白，这一过程称为滚动环翻译（RCT）。多聚蛋白可被蛋白酶或自切割序列，在单轮起始中产生多个GOI拷贝。RCT的效率可以是单次翻译的100倍。英国MRC分子生物学实验室Venki Ramakrishnan（2009年诺贝尔化学奖得主）团队设计RCT的circRNA构建，与单次翻译相比，可使蛋白表达高出7,000倍以上。[9]
推荐阅读：MRC-LMB诺奖团队开发反式核酶法环化RNA，突破性提升产率及滚环翻译效率
● 挖掘潜在编码circRNA，提供治疗诊断靶点
重庆医科大学肖斌团队发现在肾透明细胞癌（ccRCC）中高表达的circPDHK1，可通过编码新蛋白PDHK1-241aa，促进ccRCC的生长和转移。抑制ccRCC细胞中circPDHK1的表达，可以提高细胞对TKIs药物的敏感性。PDHK1-241aa可作为治疗ccRCC的药物研发的潜在新靶点。[10]
推荐阅读：circPDHK1编码蛋白PDHK1-241aa促进肾透明细胞癌生长和转移的作用机制
circRNA与mRNA互作
韩国科学技术院Yoon Ki Kim研究团队揭示了circRNA可通过与mRNA的3′ UTR相互作用，将其携带的外显子连接复合体（EJC）定位在mRNA的3′ UTR附近，从而靶向调控无义介导的mRNA降解(NMD)机制。人工设计的circRNA，可靶向下调mRNA水平，为circRNA在基因沉默和疾病治疗中的潜在应用开辟了广阔前景。[11]
推荐阅读：人工设计circRNA以解锁新技能：基因沉默
circRNA结合蛋白 circRNA在体内可作为分子海绵招募蛋白，该功能也是人工设计circRNA适配体的大前提。 circRNA可调控染色质的RNA结合蛋白的功能。重庆大学黄川团队发现一类富含金属响应元件的circRNA，可作为trans-acting因子，在铜胁迫过程中与ChRBP gawky特异性结合，调控多种应激胁迫基因转录，并清除受损细胞。[12] 推荐阅读：环状RNA调控染色质定位RBP的新机制 江苏省人民医院、南京医科大学第一附属医院李相成/李长贤团队发现circPCNXL2通过与STRAP相互作用激活ERK信号通路，调节miR-766-3p/SRSF1轴，促进肝内胆管癌（ICC）生长和转移。circPCNXL2可作为ICC诊断和预后生物标志物，也是一个很有前景的ICC治疗靶点。[13] 推荐阅读：circPCNXL2的表达影响肝内胆管癌肿瘤的生长和迁移 circRNA也可作为支架调节蛋白与蛋白之间的相互作用。复旦大学附属肿瘤医院唐爽/宋少莉团队发现缺氧诱导的外泌体中的circPLEKHM1可以促进PABPC1-eIF4G的相互作用，从而促使巨噬细胞M2极化，加速癌症的转移过程。circPLEKHM1靶向治疗可以显著抑制体内非小细胞肺癌（NSCLC）的转移。外泌体circPLEKHM1可作为潜在的肺癌转移预后生物标志物和治疗靶点。[14] 推荐阅读：外泌体circPLEKHM1介导肿瘤细胞和巨噬细胞间互作的促癌机制
作为miRNA sponge的circRNA，可通过竞争性结合miRNA，间接调控mRNA的稳定性。南方医科大学南方医院谭万龙团队揭示了膀胱癌来源的外泌体circRNA_0013936，作为miR-320a和miR-301b的分子海绵，上调FATP2的表达，下调RIPK3的表达，从而促进抑制性免疫。circRNA_0013936有望成为膀胱癌的有效治疗靶点。[15] 推荐阅读：膀胱癌来源的circRNA_0013936调控PMN-MDSCs免疫抑制机制
四 circRNA数据库 TCCIA：由遵义医科大学第二附属医院马虎团队开发的综合性的肿瘤免疫治疗circRNA数据库[16] 推荐阅读：肿瘤免疫环状 RNA 数据库 circBank 2.0：由吉赛生物刘明团队开发升级的circRNA信息的综合性数据库，涵盖circRNA保守性、注释、表达信息、miRNA结合位点、验证信息、可视化图、搜索功能、在线分析软件等[17] 推荐阅读：大型更新！circBank 2.0上线！多种模式生物circRNA的综合数据库 CICADA：由山东省第一医科大学孙亮团队开发，用于预测circRNA的可翻译性与翻译产物[18] 推荐阅读：CICADA：经济有效揭示circRNA编码“幽灵蛋白组”的创新算法 转化应用 一 circRNA临床检测 美国Circular Genomics公司公布的首个基于大脑富集circRNA血液生物标志物检测方法，具有预测患者对舍曲林反应，以及SSRI类抗抑郁药物总体反应的能力，有望用于指导准确的个性化治疗。 推荐阅读：Circular Genomics发布最新研究成果：证明环状RNA可准确预测对SSRI抗抑郁治疗的反应 福建师范大学冯尚源/林多团队联合福建医科大学附属肿瘤医院许元基团队基于表面增强拉曼光谱联合催化发夹组装技术开发的光学纳米生物传感器，能高效检测血液样本中与肺癌相关的circRNA，为早期肺癌的筛查和治疗提供了新的方法。[19] 推荐阅读：国际领先！基于SERS光谱技术超灵敏检测肺癌circRNA的方法 中山大学王佳思团队基于多分散液滴数字CRISPR/Cas13a技术开发的自动化便携式仪器，可通过CRISPR/Cas13a特异性结合circRNA的连接位点区域（BSJ）序列，结合液滴的限域效应实现目标circRNA的现场、自动化、精准定量分析，有望应用于癌症等重大疾病早期诊断。[20] 推荐阅读：基于数字CRISPR-Cas13a的circRNA定量检测方法
二 circRNA创新疗法 图2 工程化circRNA用于蛋白表达。[21]
图3 工程化circRNA的非编码功能应用。[21] circRNA在血液中同样具有较高的稳定性，作为传染病疫苗可提供强大的保护。鉴于mRNA疫苗的成功经验，传染病疫苗将是circRNA的重要的应用方向。 中国科学院广州生物医药与健康研究院冯立强/巫林平/陈凌团队开发的单剂量编码寨卡病毒两种抗原的circRNA疫苗，即可在小鼠体内提供针对寨卡病毒的有效和持久的保护作用，而不会诱导明显的登革热抗体依赖性增强效应。[22] 推荐阅读：单剂量circRNA疫苗有效预防寨卡病毒感染，而不会增强登革热严重程度 中国科学院武汉病毒研究所龚睿/揣侠团队、环码生物王泽峰团队联合中国科学技术大学Sandra Chiu团队开发的混合多种编码猴痘病毒不同抗原的circRNA，可触发针对猴痘病毒的全面、有效保护。[23] 推荐阅读：环状RNA疫苗新研究滚烫出炉——环码团队开发猴痘环状RNA疫苗新进展！ 与线性mRNA相比，较少剂量的自我扩增mRNA（SAM）疫苗即可在较长时间内产生所需数量的抗原。然而，SAM RNA存在序列较长、可能引入突变、免疫原性较高、作用机制不稳定等问题。印度生物技术部转化健康科学与技术研究所Milan Surjit团队揭示了相比SAM，circRNA疫苗更安全地表达SARS-CoV-2-RBD抗原，并提供针对SARS-CoV-2更有效的保护。[24] 推荐阅读：环状RNA比自扩增RNA疫苗更有效对抗SARS-CoV-2 华中农业大学赵凌团队开发整合编码相应抗原和佐剂趋化因子配体CXCL13的circRNA疫苗，可以增强针对流感病毒、SARS-CoV-2的交叉反应抗体提供更广泛的保护，还可针对狂犬病毒提供全面的保护。[25] 推荐阅读：靶向淋巴结的circRNA疫苗共表达佐剂和抗原，解锁单剂量疫苗开发潜力！ 中山大学公共卫生学院（深圳）陈耀庆/舒跃龙团队联合湖南大学郑克威团队，利用circRNA编码含有N1、N2和乙型流感病毒NA抗原的circRNA疫苗，可以引发针对异源流感的广谱NA免疫，对开发广谱流感疫苗，并控制流感和防范潜在的大流行至关重要。[26] 推荐阅读：circRNA多价疫苗诱导针对流感病毒的广泛保护
肿瘤疫苗类型包括肽/蛋白、树突状细胞(DC)和核酸(包括DNA和RNA疫苗)。其中RNA疫苗可在细胞质内快速表达抗原，从而导致强大的免疫激活，还可避免基因组整合和T细胞耐受性相关风险。加之circRNA的独特优势，可成为极具前景的肿瘤疫苗载体。 斯坦福大学的张元豪和Wender研究团队利用circRNA编码卵清蛋白 (OVA)[27]，多伦多大学李博文团队利用circRNA编码IL-12[28]、福建医科大学孟超肝胆医院刘小龙/赵必星团队利用circRNA编码新抗原PTPN2多肽片段[29]，结果发现这些circRNA肿瘤疫苗均可在模型体内诱导强烈的抗肿瘤免疫反应，且能强效、安全、稳定抑制肿瘤生长，甚至清除肿瘤，效果显著优于线性mRNA，且无明显副作用。 推荐阅读：开发肝外靶向、可调控可预测的GSer-CARTs转运体，高效递送circOVA有效诱导免疫反应并抑制肿瘤生长 推荐阅读：肿瘤定制LNP有效递送IL-12 circRNA增强肿瘤免疫疗法效果 推荐阅读：环状RNA肝癌新抗原疫苗有效刺激抗肿瘤免疫反应 中山大学附属第一医院张弩团队联合吉赛生物团队开发表达lncRNA编码肽肿瘤抗原的疫苗circH19-vac，可触发针对胶质母细胞瘤的强效细胞毒性T细胞反应并抑制肿瘤生长。[30] 推荐阅读：翻译组技术发掘肿瘤诊疗新靶点，工程化环状RNA疫苗对脑胶质瘤治疗显著 circRNA还有望成为优越的肿瘤抗原载体，开发有效的DC疫苗。吉林大学张海红团队开发编码肿瘤抗原FAPα和survivin的circRNA DC疫苗，可显著抑制肿瘤生长，与吉西他滨药物进行联合治疗，显著延长了胰腺癌小鼠的存活率。[31] 推荐阅读：circRNA DC肿瘤疫苗联合Gem有望成为胰腺癌的有效疗法 图4 circRNA疫苗激活免疫反应。[32]
CAR-T疗法 推荐阅读：PIE法合成的无痕circRNA用于CAR-T疗法展现优越的抗肿瘤疗效 circRNA还为体内CAR-T疗法提供了优秀的平台，复旦大学璩良团队利用免疫细胞趋向性的LNP体内递送编码anti-HER2 CAR蛋白的circRNA，可显著抑制肿瘤生长，并诱导促炎症肿瘤微环境，联合肿瘤疫苗还可协同增强抗肿瘤活性。[34]此外，环码生物杨赟联合北京大学邓觅/苗蕾团队，利用编码anti-uPAR CAR蛋白circRNA，可在单核/巨噬细胞和衰老成纤维细胞中有效表达，具有治疗肝纤维化和类风湿性关节炎等炎症性衰老的潜力。[35] 推荐阅读：利用circRNA体内表达CAR和肿瘤抗原协同促进抗肿瘤免疫 推荐阅读：基于新型LNP和circRNA靶向脾脏和T细胞表达开发体内CAR-T疗法，促进炎症性衰老治疗
circRNA可长效稳定表达蛋白，可突破蛋白疗法不稳定或容易导致不耐受的限制。科锐迈德孙振华、普瑞康生物曹辉联合东南大学-莫纳什大学联合研究院佟振博团队向间充质干细胞转染编码FGF18蛋白的circRNA，可在大鼠骨关节炎模型中显著促进了软骨修复。[36] 推荐阅读：利用甘油基LNP递送编码FGF18的circRNA改造间充质干细胞，促进关节炎模型大鼠软骨修复 东南大学李新松团队联合东南大学附属中大医院郭宗科团队开发的单剂U-LNP/VEGF-A circRNA制剂即可原位长效表达和释放VEGF-A，第12天即可使小鼠糖尿病创面几乎完全愈合，效果显著优于线性VEGF-A mRNA和rhVEGF。[37] 推荐阅读：开发U-LNP/VEGF-A circRNA制剂促进糖尿病足溃疡模型创面愈合 此外，中山大学中山眼科中心谢志团队利用circRNA编码NGF，可显著提高视网膜神经节细胞的存活率，效果远优于重组NGF蛋白治疗，为治疗青光眼等视网膜神经退行性疾病提供了新的希望。[38] 推荐阅读：利用LNP-circNGF为视网膜神经节细胞提供持续和强效的保护
干细胞疗法 美国加州大学Prashant Mali团队将编码分化调控因子的circRNA转染至多能干细胞，可精准调控其分化方向，为干细胞工程的应用与发展开辟了全新的道路。[39] 推荐阅读：环状RNA新应用：有效促进细胞工程和基因组/表观基因组工程
基因编辑 基因编辑疗法可以通过纠正致病突变，治疗遗传病。RNA介质的短效编辑器为瞬时表达，可避免由基因编辑器持续作用所带来的脱靶效应的累积，保证了疗法的安全性；circRNA相比线性RNA稳定性更高，免疫原性更低，保证了基因编辑疗法的有效性。利用circRNA编码CRISPR/Cas或锌指蛋白等编辑蛋白，或设计环状引导RNA，共同为基因编辑疗法提供了新策略。 ● circRNA编码编辑蛋白 美国加州大学Prashant Mali团队利用circRNA编码DNA甲基转移酶DNMT3A-3L和ZF-KRAB融合蛋白，可有效抑制与心血管疾病风险有关的PCSK9的表达。利用circRNA编码CRISPRoff系统的核酸酶失活Cas9（dCas9）、KRAB、DNMT3A-3L融合蛋白通过表观组编辑，可在sgRNA的引导下特异性抑制B2M基因。[39] 推荐阅读：环状RNA新应用：有效促进细胞工程和基因组/表观基因组工程 此外，中国台湾国家卫生研究院余佳益团队利用circRNA编码修饰的Cas13以靶向ER (erCas13)，在sgRNA的引导下，可显著降低黄病毒感染水平。[40] 推荐阅读：利用cis核酶合成的circRNA表达Cas13有效对抗RNA病毒 ● 引导编辑器 中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞团队在circRNA中串联置入靶向多个位点的多个crRNA，以及靶向多个位点的RTT-PBS序列，可引导基于Cas12a开发的引导编辑器系统在人类细胞系中同时编辑多达四个基因。[41] 推荐阅读：高彩霞研究组利用环状RNA开发基于Cas12a的引导编辑器 另外，德国美因茨分子生物研究所Edward A. Lemke团队利用环状gRNA引导的假尿嘧啶合成酶dyskerin（DKC1）构建人工膜样细胞器，可以显著增强mRNA假尿嘧啶修饰，并通过Ψ修饰靶向抑制终止密码子，可用于治疗遗传性果糖不耐受等过早终止密码子疾病。[42] 推荐阅读：环状gRNA增强靶向RNA修饰，推进过早终止密码子疾病的RNA疗法开发
适配体 适配体是细胞中表达的短结构DNA或RNA，用于结合特定靶标并操纵细胞内过程。circRNA具有高稳定性、特殊折叠和低免疫原性，且内源性circRNA也可与特定蛋白相互作用，因而circRNA具备改造为新型RNA适配体的潜在生物医学应用前景。 陈玲玲团队利用腺相关病毒（AAV）将具有短双链结构的circRNA（ds-cRNA）适配体递送到神经元和小胶质细胞中，能够安全且有效抑制过度激活的蛋白激酶R（PKR），实现对阿尔茨海默病小鼠的神经保护、增强其空间学习和记忆能力。[43] 推荐阅读：利用AAV递送环形RNA适配体，治疗阿尔茨海默病 类似地，陈玲玲团队利用靶向脾脏的LNP递送ds-cRNA适配体，可实现PKR异常激活相关的炎性疾病小鼠模型银屑病的干预治疗。[44] 推荐阅读：利用环形RNA适配体实现银屑病小鼠模型的干预治疗
发挥内源性circRNA功能 针对功能性内源性circRNA治疗靶点，通过干预内源性circRNA的表达，可以开发更多创新疗法。 中国人民解放军总医院付小兵/张翠萍联合中山大学附属第七医院李海红团队发现含高丰度内源性circCDK13可通过形成circCDK13-IGF2BP3-mRNA复合物，稳定并上调CD44和c-MYC的表达。设计高丰度circCDK13的工程化EV，能促进糖尿病小鼠模型的伤口愈合。[45] 推荐阅读：利用细胞外囊泡负载circCDK13促进糖尿病模型创面愈合 江苏省肿瘤医院许林/董高超/蒋峰团队发现肺腺癌中cEMSY可作为免疫原性细胞死亡诱导剂，瘤内给药cEMSY-LNP使LUAD细胞对anti-PD-1治疗增敏，提高肺腺癌的免疫治疗效果。[46] 推荐阅读：内源性circRNA能否成药？利用cEMSY-LNP提高肺腺癌的免疫治疗效果
三 circRNA制备工艺及递送策略
circRNA环化策略 目前已经开发了多种circRNA环化策略，以核酶环化法最为常用，多项研究基于这个策略进行了技术升级。 ● I型内含子自剪接法 清华大学喻国灿、新加坡国立大学永禄林医学院陈小元联合山西高等创新研究院刘志达团队，基于I型内含子建立的增强型嵌合PIE系统（CPIE系统），可实现RNA高效环状化，最大限度减少circRNA中残留多余序列。[47]而复旦大学章旭耀团队联合美国宾夕法尼亚大学华先欣团队同样基于I型内含子建立的Hi-Scarless-PIE实现了circRNA的量产、无痕（no scar）制备。[45] 推荐阅读：体外合成环状RNA的增强型CPIE系统，有望促进circRNA疫苗开发！ 推荐阅读：利用PIE法合成的无痕circRNA用于CAR-T疗法展现优越的抗肿瘤疗效 ● II型内含子自剪接法 美国加州大学Prashant Mali团队基于II型内含子开发的平台可以有效体外制备circRNA (ocRNA)，还可以利用内源性普遍表达的RtcB蛋白在细胞内环化生成circRNA (icRNA)。[39] 推荐阅读：环状RNA新应用：有效促进细胞工程和基因组/表观基因组工程 ● 顺式作用连接酶核酶法 中国台湾国家卫生研究院余佳益团队利用系统筛选的顺式作用连接酶核酶（RzL）对单链RNA进行共价环化，最小化了RzL作用所需的RNA序列，RzL策略高度依赖于酶-底物RNA配对产生circRNA，因而没有RNA副产物。[40] 推荐阅读：利用cis核酶合成的circRNA表达Cas13有效对抗RNA病毒 艾博生物英博团队开发高效成环顺式剪接系统（Cis系统），可延长蛋白表达时间、降低免疫原性，并具有剪接位点设计灵活性等优势。[48] 推荐阅读：突破海外专利壁垒，艾博生物成功研发出基于Cis系统的环状RNA ● 反式作用连接酶核酶法 英国MRC分子生物学实验室Venki Ramakrishnan团队基于反式核酶开发TRIC和TERIC的RNA环化方法，可以实现RNA的高效环化，提高产量，且可合成长序列和完全修饰的circRNA。[9] 推荐阅读：MRC-LMB诺奖团队开发反式核酶法环化RNA，突破性提升产率及滚环翻译效率 ● RNA LEGO 此外，麻省理工学院化学系/Broad研究所王潇团队基于多种连接酶的mRNA-寡聚核苷酸组装策略（RNA LEGO），对circRNA化学修饰和拓扑结构改造，大幅提高了其在小鼠体内的蛋白生产能力，为mRNA翻译起始机制及相关化学修饰设计提供了新见解。[49] 推荐阅读：RNA“乐高”：合成多5′帽枝状mRNA及含帽circRNA，大幅提高RNA药物翻译效率
纯化策略 circRNA因合成策略复杂及多样化，纯化仍是制备的关键难题。目前，纯化策略主要包括核酸外切酶去除线性RNA杂质，磷酸酶中和免疫原性三磷酸基团，以及凝胶电泳、HPLC、亲和层析和超滤等分离技术。然而，开发circRNA新疗法需优化大规模纯化策略，以实现高纯度和高产量。 中国食品药品检定研究院徐苗团队建立RT-HPLC纯化法，明显分离circRNA、nicked RNA和precusorRNA，可用于分析circRNA疫苗纯度及降解产物。同时，研究还发现在热加速稳定性实验中，circRNA 降解模式为： circRNA→Nicked→RNA降解片段。[50] 推荐阅读：中检院建立RT-HPLC法分析circRNA疫苗纯度及降解产物 西班牙 Certest Biotec S.L公司团队在circRNA序列中添加PloyA，利用Oligo dT亲和层析技术纯化circRNA，得到circRNA的占比更高，且在细胞水平和体内的表达效果均优于kit试剂盒以及HPLC纯化得到的circRNA。[51] 推荐阅读：大规模制备circRNA: 从Oligo dT亲和层析到冻干制剂 中国科学院纳米生物效应与安全性重点实验室曹宇虹团队利用纤维素过滤去除dsDNA，结合酶处理的逐步纯化策略，用于circRNA纯化，显著提高circRNA回收率，降低免疫原性。[52] 推荐阅读：新纯化策略有效提高工程circRNA生产和表达效率 类似地，美国克莱姆森大学Scott M. Husson团队利用聚醚砜（PES）膜从IVT产物中超滤纯化circRNA，大幅提升纯度及产率，突出了超滤在研究规模上是一种优越的circRNA纯化方法，也可以在基于circRNA的治疗药物的大规模生产中发挥关键作用。[53] 推荐阅读：超滤纯化工程化circRNA，大幅提升纯度及产率
递送策略 基于mRNA疫苗的成功经验，纳米脂质颗粒（LNP）已成为当前主流的RNA递送系统。然而，针对circRNA更高效、精准和安全的递送需求，LNP体系仍需进一步优化。优化策略主要包括调整脂质比例、改变脂质特性以及添加非脂质成分等。综合成本、疗效与安全性，改变脂质特性成为当前较主流的策略。 ● 添加非脂质成分LNP 华中农业大学赵凌团队利用马来酰亚胺/硫醇将anti-DEC-205抗体共轭修饰到LNP，可促进靶向淋巴结递送circRNA。[25] 推荐阅读：靶向淋巴结的circRNA疫苗共表达佐剂和抗原，解锁单剂量疫苗开发潜力！ ● 改变脂质特性LNP 多伦多大学李博文团队引入组合化学的Ugi四组分反应合成并筛选针对特定肿瘤定制的LNP，在肺癌细胞中转染circRNA疫苗的效率比行业标准LNP（ALC-0315）提高了四倍，同时提供了有效的免疫激活。[28] 推荐阅读：肿瘤定制LNP有效递送IL-12 circRNA增强肿瘤免疫疗法效果 环码生物杨赟联合北京大学邓觅/苗蕾团队开发含有新型拟心磷脂磷酰胺脂质的LNP，增加了硬度和相分离，促进T细胞偏向性摄取。[35] 推荐阅读：基于新型LNP和circRNA靶向脾脏和T细胞表达开发体内CAR-T疗法，促进炎症性衰老治疗 复旦大学璩良团队通过改造LNP中阳离子脂质头部和尾部基团，可得到免疫细胞趋向性的LNP体内有效递送circRNA。[34] 推荐阅读：复旦大学璩良团队利用circRNA体内表达CAR和肿瘤抗原协同促进抗肿瘤免疫 科锐迈德孙振华、普瑞康生物曹辉联合东南大学-莫纳什大学联合研究院佟振博团队具有支链尾部和五个酯键的专有可电离甘油脂质（TG6A），使用TG6A构建的LNP成功向间充质干细胞转染circRNA。[36] 推荐阅读：利用甘油基LNP递送编码FGF18的circRNA改造间充质干细胞，促进关节炎模型大鼠软骨修复 ● GSer-CARTs 除了LNP这种典型多阴离子转运体外，斯坦福大学张元豪和Wender团队还有研究通过电荷抵消动态控制胍离子活动性开发的肝外靶向、可调控、可预测的GSer-CARTs转运体，实现了circOVA的体内高效递送。[27] 推荐阅读：开发肝外靶向、可调控可预测的GSer-CARTs转运体，高效递送circOVA有效诱导免疫反应并抑制肿瘤生长 临床进展 circRNA的临床转化，既依赖基础研究突破，也需要产业生态推动。2024年，行业协同发力，融资为产业发展注入动力，广泛合作带来前沿理念与创新思维，circRNA药物开发事业迈向新高度。 一 临床试验阶段 转录本生物在研疗法RXRG001的IND获得许可，即将在美国开展临床试验SPRINX-1。RXRG001是全球首个获美国食品药品监督管理局（FDA）批准进入IND的circRNA疗法，SPRINX-1试验将评估其在辐射诱导的口干症和唾液分泌减退患者中的安全性和有效性。 推荐阅读：全球首个环状RNA药物获FDA新药临床试验许可 环码生物用于治疗缺血性心脏病的HM2002注射液在上海交通大学医学院附属瑞金医院开展IIT试验并完成首例患者注射给药。三个月后，HM2002注射液成为中国首个获得国家药品监督管理局（NMPA）临床试验许可（IND）的环形RNA药物。 推荐阅读：环形RNA药物-HM2002注射液完成首例患者给药，正式进入临床试验阶段！ 推荐阅读：重大突破！环码生物环形RNA疗法摘下国内NMPA临床试验许可首冠 推荐阅读：环码生物宣布与百时美施贵宝达成可行性研究合作 截至本文发布日，CirCode官网公布的管线分布与进展
二 临床前研究阶段 Orna Therapeutics（美国） Orna Therapeutics在2024年收购ReNAgade Therapeutics，双强携手推进用于治疗肿瘤和自身免疫性疾病的新型体内RNA疗法panCAR项目的开发。在ESGCT年会上，Orna展示了研究数据：来自健康供体的原代造血干细胞祖细胞（HSPC）的编辑率显著提高到约80%。Orna的STEM技术旨在解决β血红蛋白病，包括镰状细胞病（SCD）和输血依赖性β地中海贫血（TDT）。 推荐阅读：双强合并！Orna战略收购ReNAgade以巩固其在circRNA领域的领导地位 推荐阅读：结果积极！Orna公布基于环状RNA和CRISPR平台的体内骨髓SiTu编辑系统临床前研究数据 截至本文发布日，Orna Therapeutics官网公布的管线分布与进展
Sail Biomedicines（美国） Sail Biomedicines宣布获得比尔&梅林达·盖茨基金会的两笔赞助，用于推进Endless RNA™平台开发治疗疟疾的分泌型单克隆抗体和疫苗。随后，Sail Biomedicines公布Endless RNA™平台可能为那些不适用现有治疗的10%-15%囊性纤维化患者提供治疗选择。 推荐阅读：Sail Biomedicines获得盖茨基金的赞助，用于开发新型环状RNA药物来对抗疟疾 推荐阅读：Sail Biomedicines发布治疗囊性纤维化的环状RNA药物研究的最新进展 截至本文发布日，Sail Biomedicines官网公布的管线分布与进展
Circular Genomics（美国） Circular Genomics在新年伊始完成2024年circRNA全球领域的首笔融资，为推出全球首个基于circRNA的临床检测做准备。Michael F. Ackermann博士的加入，将为其助推首个circRNA抗抑郁疗法。 推荐阅读：推进精神类疾病精准诊疗丨美国环状RNA检测公司Circular Genomics获830万美元A轮融资 推荐阅读：Circular Genomics任命Michael Ackermann博士为科学顾问委员会新成员，助推首个环状RNA抗抑郁疗法 截至本文发布日，Circular Genomics官网公布的管线分布与进展
Circio（挪威） Circio除了开发针对KRAS突变的癌症疫苗外，还建立了circRNA平台circVec，利用DNA和病毒载体生产多功能circRNA。在2024年第27届ASGCT年会上，Circio展示了circRNA与线性mRNA相比在体内的优越性，以及Circio的“移除和替代（remove-&-replace）” 基因疗法的技术概念验证，该疗法可满足α1－抗胰蛋白酶缺乏症（AATD）的医疗需求。 推荐阅读：发挥circRNA的治疗潜力：Circio首席执行官Erik Digman Wiklund博士专访 推荐阅读：Circio在ASGCT 2024上展示circVec基因治疗概念的临床前验证数据 截至本文发布日，Circio官网公布的管线分布与进展
Ginkgo Bioworks（美国） Ginkgo Bioworks收购用于序列设计的人工智能平台Patch Biosciences，以加强其研发管线，强化circRNA和启动子筛选平台技术。 推荐阅读：Ginkgo Bioworks收购Patch Biosciences，以补充环状RNA和启动子筛选平台技术
休斯顿卫理公会研究所（美国） 全球卫生非营利组织流行病防范创新联盟（CEPI）与美国休斯顿卫理公会研究所（HMRI）合作，重点关注circRNA候选疫苗的设计和临床前评估，为疫苗平台建立临床前概念验证。 推荐阅读：流行病防范创新联盟与休斯顿卫理公会研究所合作探索前景广阔的新型环状RNA疫苗 展望 2024中国龙年，circRNA领域从基础研究，到转化应用都取得了丰硕成果，circRNA药物开发更是实现了临床里程碑式的突破，振奋人心。然而，circRNA创新疗法的未来发展仍面临诸多问题与挑战。 作为新型核酸技术，circRNA创新疗法在序列设计、翻译效率、功能机制、免疫原性等关键领域的研究尚不够深入，有待进一步挖掘。这需要借助空间多组学技术以及人工智能等多学科的交叉融合，全方位深入挖掘circRNA的功能特性。创新疗法的开发方向不仅局限于蛋白表达，还应拓展基因编辑工具、核酸适配体等药物开发方向，为创新治疗提供更多靶点与策略。 工程化circRNA的合成、纯化与递送策略，虽解决方案多样，但个性化特征明显，缺乏统一且高效的通用模式。在原液放大生产环节，需筛选并开发更优的序列设计、环化及纯化策略，以提高产量，同时降低副产物生成。在药物递送环节，亟需开发出安全性更高、效率更优且靶向性更强的递送材料，以满足不同适应症的多样化需求，切实解决circRNA药物递送的关键瓶颈问题。 中国两家企业的circRNA药物获得IND批准，充分彰显了我国在circRNA药物研发领域处于全球领先地位。如何保持领先优势，加速推进产业化，成为摆在眼前的重要课题。政策层面，需加快推进以疾病预防与治疗为导向的临床转化研究，大力支持研究者发起的临床研究（IIT），加速创新疗法安全性与有效性的验证。监管层面，要持续完善相关审评审批程序，加快制定并出台circRNA临床审批标准，推动circRNA前沿技术的产业化进程。 尽管circRNA领域挑战重重，但circRNA疗法未来前景依然可期。期待学术界、产业界与投资界携手共进，让circRNA“暗物质”发出光芒，造福人类健康。
参考文献 [1]Zheludev IN, et al. Viroid-like colonists of human microbiomes. Cell. 2024 Nov 14;187(23):6521-6536.e18. doi: 10.1016/j.cell.2024.09.033. [2]Zheludev IN, et al. Viroid-like colonists of human microbiomes. Cell. 2024 Nov 14;187(23):6521-6536.e18. doi: 10.1016/j.cell.2024.09.033. [3]Li Q, et al. ZC3H14 facilitates backsplicing by binding to exon-intron boundary and 3′ UTR. Mol Cell. 2024 Nov 21;84(22):4314-4333.e9. doi: 10.1016/j.molcel.2024.10.001. [4]He Z, et al. Invention of circRNA promoting RNA to specifically promote circRNA production. Nucleic Acids Res. 2024 Sep 23;52(17):e83. [5]Ngo LH, et al. Nuclear export of circular RNA. Nature. 2024 Mar;627(8002):212-220. doi: 10.1038/s41586-024-07060-5. Epub 2024 Feb 14. Erratum in: Nature. 2024 Mar;627(8005):E12. doi: 10.1038/s41586-024-07281-8. [6]Cao SM, et al. Altered nucleocytoplasmic export of adenosine-rich circRNAs by PABPC1 contributes to neuronal function. Mol Cell. 2024 Jun 20;84(12):2304-2319.e8. doi: 10.1016/j.molcel.2024.05.011. [7]Huang S, et al. Advancing the next generation of cancer treatment with circular RNAs in CAR-T cell therapy. Biomed Pharmacother. 2024, 181:117753. [8]Qianyun Lu, et al. Systematic screen of RNA binding proteins that enhance circular RNA translation. bioRxiv 2024.11.07.622558; [9]Du Y, et al. Efficient circular RNA synthesis for potent rolling circle translation. Nat Biomed Eng. 2024 Dec 13. doi: 10.1038/s41551-024-01306-3. [10]Huang B, et al. A novel peptide PDHK1-241aa encoded by circPDHK1 promotes ccRCC progression via interacting with PPP1CA to inhibit AKT dephosphorylation and activate the AKT-mTOR signaling pathway. Mol Cancer. 2024 Feb 15;23(1):34. doi: 10.1186/s12943-024-01940-0. [11]Boo SH, et al. Circular RNAs trigger nonsense-mediated mRNA decay. Mol Cell. 2024 Dec 19;84(24):4862-4877.e7. doi: 10.1016/j.molcel.2024.11.022. [12]Su R, et al. A circular RNA-gawky-chromatin regulatory axis modulates stress-induced transcription. Nucleic Acids Res. 2024 Apr 24;52(7):3702-3721. doi: 10.1093/nar/gkae157. [13]Liu S, et al. CircPCNXL2 promotes tumor growth and metastasis by interacting with STRAP to regulate ERK signaling in intrahepatic cholangiocarcinoma. Mol Cancer. 2024 Feb 17;23(1):35. doi: 10.1186/s12943-024-01950-y. [14]Wang D, et al. Hypoxic Exosomal circPLEKHM1-Mediated Crosstalk between Tumor Cells and Macrophages Drives Lung Cancer Metastasis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jun;11(22):e2309857. doi: 10.1002/advs.202309857. Epub 2024 Mar 21. [15]Shi X, et al. Bladder-cancer-derived exosomal circRNA_0013936 promotes suppressive immunity by up-regulating fatty acid transporter protein 2 and down-regulating receptor-interacting protein kinase 3 in PMN-MDSCs. Mol Cancer. 2024 Mar 9;23(1):52. doi: 10.1186/s12943-024-01968-2. [16]Wang S, et al. TCCIA: a comprehensive resource for exploring CircRNA in cancer immunotherapy. J Immunother Cancer. 2024 Jan 11;12(1):e008040. doi: 10.1136/jitc-2023-008040. [17]Liu M, et al. Circbank: a comprehensive database for circRNA with standard nomenclature. RNA Biol. 2019 Jul;16(7):899-905. doi: 10.1080/15476286.2019.1600395. [18]Fan L, et al. CICADA: a circRNA effort toward the ghost proteome. Nucleic Acids Res. 2025 Jan 7;53(1):gkae1179. doi: 10.1093/nar/gkae1179. [19]Xu L, et al. Optical Nanobiosensor Based on Surface-Enhanced Raman Spectroscopy and Catalytic Hairpin Assembly for Early-Stage Lung Cancer Detection via Blood Circular RNA. ACS Sens. 2024 Apr 26;9(4):2020-2030. doi: 10.1021/acssensors.3c02810. [20]Wang K, et al. Quantitative detection of circular RNA and microRNA at point-of-care using droplet digital CRISPR/Cas13a platform. Biosens Bioelectron. 2025 Jan 1;267:116825. doi: 10.1016/j.bios.2024.116825. [21]Cao, X, et al. Engineering circular RNA medicines. Nat Rev Bioeng. 2024. [22]Liu X, et al. A single-dose circular RNA vaccine prevents Zika virus infection without enhancing dengue severity in mice. Nat Commun. 2024 Oct 16;15(1):8932. doi: 10.1038/s41467-024-53242-0. [23]Zhou J, et al. Circular RNA vaccines against monkeypox virus provide potent protection against vaccinia virus infection in mice. Mol Ther. 2024 Jun 5;32(6):1779-1789. doi: 10.1016/j.ymthe.2024.04.028. [24]Singh ON, et al. Comparison of immunogenicity and protection efficacy of self-amplifying and circular mRNA vaccines against SARS-CoV-2. bioRxiv 2024.08.23.609366. [25]Wan J, et alL. CXCL13 promotes broad immune responses induced by circular RNA vaccines. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024 Oct 29;121(44):e2406434121. doi: 10.1073/pnas.2406434121. [26]Yue X, et al. CircRNA based multivalent neuraminidase vaccine induces broad protection against influenza viruses in mice. NPJ Vaccines. 2024 Sep 16;9(1):170. doi: 10.1038/s41541-024-00963-4. [27]Li Z, et al. Organ- and Cell-Selective Delivery of mRNA In Vivo Using Guanidinylated Serinol Charge-Altering Releasable Transporters. J Am Chem Soc. 2024 May 29;146(21):14785-14798. doi: 10.1021/jacs.4c02704. [28]Xu S, et al. Tumor-Tailored Ionizable Lipid Nanoparticles Facilitate IL-12 Circular RNA Delivery for Enhanced Lung Cancer Immunotherapy. Adv Mater. 2024 Jul;36(29):e2400307. doi: 10.1002/adma.202400307. [29]Wang F, et al. Circular RNA-based neoantigen vaccine for hepatocellular carcinoma immunotherapy. MedComm (2020). 2024 Jul 29;5(8):e667. doi: 10.1002/mco2.667. [30]Chen J, et al. Lnc-H19-derived protein shapes the immunosuppressive microenvironment of glioblastoma. Cell Rep Med. 2024 Nov 19;5(11):101806. doi: 10.1016/j.xcrm.2024.101806. [31]Cai Z, et al. CircRNA-loaded DC vaccine in combination with low-dose gemcitabine induced potent anti-tumor immunity in pancreatic cancer model. Cancer Immunol Immunother. 2025 Jan 3;74(2):68. doi: 10.1007/s00262-024-03924-x. [32]Xie J, et al. Circular RNA: A promising new star of vaccine. J Transl Int Med. 2023, 11(4):372-381. [33]Hu Q, et al. Scarless circular mRNA-based CAR-T cell therapy elicits superior anti-tumor efficacy. bioRxiv. 2024.08.05.606578. [34]Wang Y, et al. Synergically enhanced anti-tumor immunity of in vivo CAR by circRNA vaccine boosting. bioRxiv. 2024.07.05.600312. [35]Zhang Z, et al. Cardiolipin-mimic lipid nanoparticles without antibody modification delivered senolytic in-vivo CAR-T therapy for inflamm-aging. bioRxiv. 2024.11.21.624667. [36]Huang K, et al. FGF18 encoding circular mRNA-LNP based on glycerolipid engineering of mesenchymal stem cells for efficient amelioration of osteoarthritis. Biomater Sci. 2024 Aug 20;12(17):4427-4439. doi: 10.1039/d4bm00668b. [37]Liu J, et al. A single dose of VEGF-A circular RNA sustains in situ long-term expression of protein to accelerate diabetic wound healing. J Control Release. 2024 Sep;373:319-335. doi: 10.1016/j.jconrel.2024.07.018. [38]Jiang W, et al. Circular RNA-based therapy provides sustained and robust neuroprotection for retinal ganglion cells. Mol Ther Nucleic Acids. 2024 Jun 17;35(3):102258. doi: 10.1016/j.omtn.2024.102258. [39]Tong M, et al. Robust genome and cell engineering via in vitro and in situ circularized RNAs. Nat Biomed Eng. 2024 Aug 26. doi: 10.1038/s41551-024-01245-z. [40]Su CI, et al. A cis-acting ligase ribozyme generates circular RNA in vitro for ectopic protein functioning. Nat Commun. 2024 Aug 4;15(1):6607. doi: 10.1038/s41467-024-51044-y. [41]Liang R, et al. Prime editing using CRISPR-Cas12a and circular RNAs in human cells. Nat Biotechnol. 2024 Dec;42(12):1867-1875. doi: 10.1038/s41587-023-02095-x. Epub 2024 Jan 10. Erratum in: Nat Biotechnol. 2024 Dec;42(12):1921-1922. doi: 10.1038/s41587-024-02160-z. [42]Schartel L, et al. Selective RNA pseudouridinylation in situ by circular gRNAs in designer organelles. Nat Commun. 2024 Oct 24;15(1):9177. doi: 10.1038/s41467-024-53403-1. [43]Feng X, et al. Circular RNA aptamers ameliorate AD-relevant phenotypes by targeting PKR. bioRxiv. 2024.03.27.583257. [44]Guo SK, et al. Therapeutic application of circular RNA aptamers in a mouse model of psoriasis. Nat Biotechnol. 2024 Apr 23. doi: 10.1038/s41587-024-02204-4. [45]Huang Q, et al. circCDK13-loaded small extracellular vesicles accelerate healing in preclinical diabetic wound models. Nat Commun. 2024 May 9;15(1):3904. doi: 10.1038/s41467-024-48284-3. [46]Zhang Y, et al. The circRNA cEMSY Induces Immunogenic Cell Death and Boosts Immunotherapy Efficacy in Lung Adenocarcinoma. Cancer Res. 2024 Nov 12. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-24-1484. [47]Wang L, et al. Developing an enhanced chimeric permuted intron-exon system for circular RNA therapeutics. Theranostics. 2024 Sep 9;14(15):5869-5882. doi: 10.7150/thno.98214. [48]Qi S, et al. Efficient circularization of protein-encoding RNAs via a novel cis-splicing system. Nucleic Acids Res. 2024 Sep 23;52(17):10400-10415. doi: 10.1093/nar/gkae711. [49]Chen H, et al. Chemical and topological design of multicapped mRNA and capped circular RNA to augment translation. Nat Biotechnol. 2024 Sep 23. doi: 10.1038/s41587-024-02393-y. [50]Cheng F, et al. Study on the Characterization and Degradation Pattern of Circular RNA Vaccines Using an HPLC Method. Chemosensors. 2024; 12(7):120. [51]Broset E., et al.A complete approach for circRNA therapeutics from purification to lyophilized delivery using novel ionizable lipids. bioRxiv 2024.10.28.620632. [52]Zhang Z., et al. Mitigating Cellular Dysfunction by Addressing Contaminants in Synthetic circRNA. bioRxiv 2024.09.17.613157. [53]Guillen-Cuevas K., et al. Purifying circular RNA by ultrafiltration. bioRxiv 2024.12.04.626383.