由于稳定性高、表达持久等特性，circRNA在基因编辑领域已经逐渐展现优越的潜能。除了可设计环状gRNA稳定引导编辑器进行精准有效的基因编辑[1,2]，还可以利用circRNA稳定表达编辑蛋白，如锌指核酸酶(ZFN)、Cas9、Cas12a、3A3L DNA甲基转移酶和ZF-KRAB蛋白模块融合蛋白等进行基因组编辑或表观修饰。[3,4]
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核基因组突变是多种疾病的根源，而线粒体作为细胞内具有半自主功能的细胞器，拥有独立的基因组，其基因组突变同样与多种遗传疾病密切相关，如Leigh综合征、LHON（Leber遗传性视神经病变）。动物模型的建立是线粒体疾病研究和疗法开发的关键，但模型建立的方法需进一步优化。
mitoBE
昌平实验室/北京大学魏文胜团队此前就开发了线粒体碱基编辑器（mitoBE），mitoBE结合了切口酶与单链DNA脱氨酶，可实现线粒体DNA的C到T以及A到G编辑。与DdCBE和TALED相比，mitoBE展现出卓越的链特异性，并显著降低了脱靶效应。得益于其碱基编辑能力的多功能性，mitoBE可模拟约87%的致病线粒体突变。[5]
优化的mitoBE v2
在该团队最近的研究中，优化了腺嘌呤和胞嘧啶脱氨酶，以减少对转录组和线粒体基因组的脱靶效应，从而提高了mitoBE的准确性和效率。使用这些升级的mitoBE v2，研究靶向了70个类似于人类致病变异体的小鼠线粒体DNA突变，为线粒体疾病小鼠模型构建奠定了基础。
环状RNA编码mitoBE v2
为了解决小鼠细胞中质粒转染效率低的问题，研究体外合成了编码的mitoBE v2的环状RNA。为了比较mRNA和circRNA的编辑效果，研究将靶向mt-Atp 6 T8591 C和mt-Nd 5 A12784 G位点的mRNA和circRNA，分别显微注射到单细胞期的C57 BL/6 J小鼠胚胎中。两种形式的RNA在150 ng μl−1的浓度下显示出更高的编辑效率（图1b，c），而circRNA编码的mitoBE v2表现出比mRNA更高的编辑效率。
图1 利用环状RNA编码mitoBEs v2建立线粒体疾病小鼠模型。
研究团队将circRNA编码的mitoBEs v2注射至小鼠胚胎并进行移植，结果发现在小鼠中实现了高达82%的编辑效率，而在核基因组未检测到脱靶效应。编辑的线粒体DNA在各种组织中持续存在，并且是母系遗传的，使F1代小鼠的突变率高达100%以及仅含目标位点突变的mt-Nd5 A12784G小鼠模型。（图2）
图2 mitoBEs v2高效构建线粒体疾病小鼠模型并且在各个组织广泛持久存在编辑。
高效精准建立线粒体疾病小鼠模型
通过优化转录激活子样效应子（TALE）结合位点，研究建立了一种单碱基编辑的mt-Nd5 A12784G突变小鼠模型。表型评估导致创建了mt-Atp 6 T8591 C和mt-Nd 5 A12784 G突变的小鼠模型，其表现出的表型分别对应于在Leigh综合征中观察到的心率降低和Leber遗传性视神经病变的视力丧失特征。此外，mt-Atp 6 T8591 C突变被证明比mt-Nd 5 A12784 G更有害，影响胚胎发育，并在连续几代中迅速减少。
总结
该研究充分证明了优化mitoBE v2在创建线粒体疾病小鼠模型方面的高效性和精准性，以及circRNA编码技术的稳定性，为深入探索线粒体疾病的致病机制及开发新型治疗策略提供了重要工具。
由此可见，circRNA在基因编辑领域展现出极为广阔的应用前景。然而，大多数基因编辑蛋白的分子量较大，其对应的长序列circRNA在体外合成过程中面临着诸多挑战。吉赛生物凭借深厚的技术积累和丰富的实践经验，能够提供超长序列circRNA的体外合成服务，涵盖编码Cas9、融合编辑蛋白等。此外，吉赛生物还提供可持久稳定表达Cas9的circRNA现货产品，为基因编辑研究提供了有力支持。
参考文献
[1] Liang R, et al. Prime editing using CRISPR-Cas12a and circular RNAs in human cells. Nat Biotechnol. 2024 Dec;42(12):1867-1875. doi: 10.1038/s41587-023-02095-x. Epub 2024 Jan 10. Erratum in: Nat Biotechnol. 2024 Dec;42(12):1921-1922. doi: 10.1038/s41587-024-02160-z.
[2] Schartel L, et al. Selective RNA pseudouridinylation in situ by circular gRNAs in designer organelles. Nat Commun. 2024 Oct 24;15(1):9177. doi: 10.1038/s41467-024-53403-1.
[3] Tong M, et al. Robust genome and cell engineering via in vitro and in situ circularized RNAs. Nat Biomed Eng. 2024 Aug 26. doi: 10.1038/s41551-024-01245-z.
[4] Su CI, et al. A cis-acting ligase ribozyme generates circular RNA in vitro for ectopic protein functioning. Nat Commun. 2024 Aug 4;15(1):6607. doi: 10.1038/s41467-024-51044-y.
[5] Yi, Z.Y., et al., Strand-selective base editing of human mitochondrial DNA using mitoBEs. Nature Biotechnology, 2024. 42(3).