较长序列（＞1000 nt）的circRNA和mRNA容易形成双链RNA（dsRNA）结构，可能激活蛋白激酶R（PKR），引起强烈自身免疫，限制抗原翻译效率，且容易引起免疫毒性的风险。
此前，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心陈玲玲团队，设计了具有局部双链结构的环状RNA适配体（ds-cRNA），其可特异性结合并激活蛋白激酶 R（PKR），有效治疗阿尔兹海默病和银屑病的小鼠模型。
那么，对于编码抗原或治疗性蛋白的circRNA，是否可以通过序列设计使dsRNA结构最少化，从而避免circRNA自身引起的免疫反应，减少免疫毒性，增强疗效并保证安全性？
近日，美国密歇根大学Guizhi Zhu研究团队在Nature Biomedical Engineering期刊上发表研究论文：Small circular RNAs as vaccines for cancer immunotherapy。研究通过最大限度缩短circRNA序列，开发了脂质纳米颗粒（LNP）递送的编码抗原的小环状 RNA 疫苗（＜300nt），经皮下注射后，可在小鼠体内引发相比大RNA和线性小RNA更强大且持久的 T 细胞反应，从而实现有效的肿瘤免疫治疗，尤其是与免疫检查点抑制剂联合使用时效果更佳。
高稳定性小circRNA疫苗优化
研究以MHC-I限制性卵清蛋白（OVA）257-264（OVA257-264或SIINFEKL）为模型抗原，设计小（短序列）circRNA，其中包含抗原编码肽序列、短内部核糖体进入位点（IRES）以及Kozak序列，然后通过T4 RNA连接酶和DNA夹板（DNA splints）法合成circRNA。
研究表明，使用crTMV IRES的circRNA-SIINFEKL能够更有效地促进抗原呈递和T细胞激活，相较于其他类型的IRES和线性RNA（liRNA），其在细胞内的抗原呈递和T细胞激活能力显著增强。
小circRNA疫苗的稳定性
小circRNA的热稳定性（在−20°C的溶液储存半衰期约为400天）和生物稳定性高于相应的小线性RNA、修饰mRNA和大circRNA。此外，小circRNA的高稳定性使得在细胞中至少一周内持续表达肽。
circRNA疫苗递送
研究筛选适合小circRNA疫苗递送系统，选择将circRNA包封到SM-102 LNP中，可有效递送到引流淋巴结中的抗原呈递细胞（APC）。
小circRNA免疫调节与PKR激活
小circRNA疫苗激活了树突状细胞（DC）中的视黄酸诱导基因I（RIG-I）免疫刺激途径，诱导促炎性先天免疫反应。此外，与修饰mRNA相比，小circRNA疫苗表现出较低的PKR激活水平和细胞毒性，具有良好的安全性。
小circRNA疫苗疗效对比
研究团队将小circRNA疫苗与多种改良mRNA疫苗和大circRNA疫苗进行了对比。结果显示，小circRNA疫苗可诱导更强和更持久的T细胞免疫反应，在免疫后持续至少6个月，且在免疫衰老的老年小鼠中也表现出良好的免疫效果。这使小circRNA疫苗有望在体内治疗中产生显著剂量的T细胞受体（TCR）-T细胞，从而替代离体T细胞工程。
小circRNA疫苗的广泛适用性
利用小circRNA编码多种肽抗原，也可以引发针对各种抗原的T细胞应答。这些抗原包括肿瘤相关抗原、肿瘤新抗原、癌病毒抗原和病毒抗原。在小鼠中，小circRNA疫苗降低了肿瘤免疫抑制，并增强了抗肿瘤免疫细胞的肿瘤浸润。单价或多价小circRNA疫苗，单独或与免疫检查点阻断（ICB）联合，在多个同基因肿瘤模型中显著抑制或根除肿瘤，包括免疫原性差和ICB耐药的BrafV 600E黑色素瘤。这表明小circRNA疫苗在肿瘤联合免疫治疗方面具有巨大潜力。
用于多种类型肿瘤的组合免疫疗法的单价或多价小circRNA疫苗。
总结
研究开发了一种高稳定性的小circRNA疫苗，能够在体内持久产生抗原并引发强效且持久的T细胞反应，可用于肿瘤免疫治疗。小circRNA疫苗在稳定性、免疫刺激作用和安全性方面优于传统的mRNA疫苗，显示出其在癌症免疫治疗中的巨大潜力。
原文链接
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39920212/
研究可见小circRNA具有独特的优势。然而小circRNA体外合成具有一定的难度：小circRNA具有弯曲应力更高，制备过程底物浓度更低，更容易产生分子间连接的副作用等问题，严重影响环化和纯化效率。
研究中采用T4 RNA连接酶配合DNA夹板的方法合成小circRNA。而吉赛生物通过技术升级，可利用PIE法更高效、精准地体外合成超短序列的circRNA。除了满足疗效更持久、安全性更高的小circRNA疫苗开发需求，还能开辟超短circRNA更广泛的应用，如设计作为基因编辑的gRNA和crRNA、适配体、生物传感器、环状siRNA、发挥天然circRNA功能等。